用于治疗神经元的过度兴奋的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于治疗脊髓损伤后GABA介导的突触前抑制的丧失的疗法。该治疗方案包括在脊髓创伤或缺血性损伤后，GAD65(谷氨酸脱羧酶)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)脊髓节段特异性上调以调节患者的慢性痉挛。

Methods and Compositions for the Treatment of Overexcitation of Neurons

The present invention provides a treatment for loss of GABA-mediated presynaptic inhibition after spinal cord injury. The treatment regimen includes up-regulation of GAD65 (glutamic acid decarboxylase) and VGAT (vesicle GABA transporter) spinal segments after spinal cord injury or ischemic injury to regulate chronic spasm.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗神经元的过度兴奋的方法和组合物相关文献的交叉引用本申请要求根据35U.S.C.§119(e)于2016年3月28日提交的美国系列号62/314,128的优先权，其全部内容通过引用并入本文。资助信息本专利技术是在国立卫生研究院授予的资助号NS051644-02A2的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
本专利技术一般涉及治疗脊髓损伤，且更具体地涉及脊髓创伤或缺血性损伤后调节患者的慢性痉挛的联合治疗方案。
技术介绍
脊髓损伤(创伤性或缺血性)可导致临床上定义的痉挛和僵硬的发展。导致脊髓损伤后出现痉挛的潜在机制之一被认为是局部节段性抑制的丧失，并且由此导致：i)强直运动神经元放电增加，ii)肌肉伸展期间初级传入输入增加，和/或iii)加剧对外周感觉刺激(即异常性疼痛)的反应。已显示γ-氨基丁酸(GABA)介导的突触前、周期性和相互的突触后抑制的丧失以及其在屈肌传入途径中的抑制作用的丧失代表了关键机制之一。然而，有趣的是，先前的研究已经显示Th12横断的猫的腰椎脊髓节段中脊髓实质GAD67的表达显著增加。类似地，在出生后第5天进行了胸正中脊髓横断的成年大鼠中，已经显示出在α-运动神经元膜附加(apposing)的抑制性小结(boutons)的密度增加。这些数据表明脊髓中间神经元中GABA合成酶的静态增加或者在没有特定的抑制性神经元驱动活性的存在下，脊髓创伤后与α-运动神经元的抑制性接触数量的增加，不足以预防痉挛/反射亢进的发展。除了减弱抑制的作用外，已经表明其他一些潜在的机制有助于脊髓创伤后痉挛的发展，包括：i)α-运动神经元5-HT2C受体活性的进行性增加，其在没有脑源性5-羟色胺的存在下自发变得活跃，或ii)运动神经元中氯化钾共转运蛋白KCC2的下调，并引起GABA介导的去极化。共同地，这些数据表明导致脊髓损伤(创伤性或缺血性)后痉挛发展的机制是复杂的，并且可以根据所使用的模型以及诱导损伤时实验动物的年龄而变化。临床药物治疗研究表明，全身性施用或脊髓施用巴氯芬(GABAB受体激动剂)的使用代表了最有效的抗痉挛药物治疗。虽然对于调节不同病因(包括脊髓创伤、肌萎缩脊髓侧索硬化症或中枢性中风)的痉挛是有效的，，但诸如一般镇静和进行性耐受性发展的主要副作用常常限制其长期使用。全身性施用诸如噻加宾(GABA再摄取抑制剂)的类GABA化合物的使用在临床上可接受的剂量中仅表现出弱的或不表现出抗痉挛作用，其与全身性递送后，脑或脊髓实质GABA释放的相对适度的增强相关。此外，目前可用的脊髓药物递送系统(诸如硬膜外或鞘内递送)不允许脊髓节段限制性治疗效果。这是因为影响个体肌肉群痉挛的起源可以被体部映射到特定的脊髓节段，所以通过减少不想要的副作用，节段靶向的抗痉挛治疗的发展比目前的治疗方法将具有明显的优势。因此，存在对新颖的抗痉挛治疗的需求。
技术实现思路
本专利技术基于以下观察结果：在具有缺血诱导的痉挛的大鼠中由GAD65(谷氨酸脱羧酶)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗引起抗痉挛作用，并且这样的联合治疗引起肌肉痉挛减少。因此，本专利技术提供了治疗受试者痉挛的方法。该方法包括上调GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因，从而治疗受试者的痉挛。GAD65基因和VGAT基因的上调可以是GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调，通过向受试者施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而减少痉挛。GAD65基因和VGAT基因可能过表达。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)。AAV可以是AAV9型(AAV9)。在各种实施方案中，将病毒载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。在另一方面，本专利技术提供治疗受试者痉挛的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的病毒载体，其包含编码GAD65基因和VGAT基因的多核苷酸，从而治疗受试者的痉挛。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)，并且可以直接施用于受试者的脊髓。AAV可以是AAV9型(AAV9)。在各种实施方案中，将载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。在另一方面，本专利技术提供了用于治疗患有脊髓损伤的受试者的治疗方案。该治疗方案包括施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而减少痉挛。GAD65和VGAT的上调包括施用编码GAD65和VGAT的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT并减少痉挛。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体，并且可以直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。在各种实施方案中，将载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。另一方面，本专利技术提供了表达盒，其包含与编码GAD65和VGAT的多核苷酸功能性连接的启动子或调节序列。还提供了诸如AAV9的载体，其包括诸如与编码GAD65和VGAT的多核苷酸功能性连接的启动子的调节序列。附图说明图1为显示用于实施本专利技术方法的示例性方法学的示意图。图2为显示腰椎软膜下AAV9-UBI-GFP递送后实现的转基因表达的分布的示意图。可以看到遍及灰质的中间神经元中广泛GFP表达。使用软膜下递送方法将编码GAD65(谷氨酸脱羧酶65)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的AAV9病毒注射到靶向节段中。图3A-图3D为显示慢性脊髓横断诱导的痉挛的大鼠腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送后，有效的抗痉挛和抗疼痛作用的图。图4A-图4D为显示通过腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送，在脊髓兴奋性中间神经元中混合抑制性-兴奋性神经递质表型的诱导的示意图。在第8周，经注射GAD65/VGAT基因的节段的免疫荧光分析显示两种基因的显著上调和混合抑制性/兴奋性神经递质表型的出现(GAD65或VGAT与VGLUT2(囊泡谷氨酸转运蛋白)的共表达)，(图4A和4B)。在注射对照AAV9的动物中没有发现共表达(图4C和4D)。这些数据证实了GAD65/VGAT过表达的神经元中抑制性驱动的有效诱导，其可能介导肌肉痉挛的减少。图5为显示在腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送后，痉挛大鼠中腰椎脊髓中混合的抑制性-兴奋性中间神经元和突出的DRG神经元的数量显著增加的示意图。该表显示了GAD65和VGAT表达的定量分析。具体实施方式本专利技术基于以下观察结果：具有缺血诱导的痉挛大鼠中由GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗引起抗痉挛作用，且这种联合治疗会引起肌肉痉挛减少。在描述本专利技术的组合物和方法之前，应理解本专利技术不限于所述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限定，因为本专利技术的范围仅由所附权利要求限定。如在本说明书和所附权利要求中使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗受试者痉挛的方法，包括上调GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因，从而治疗受试者的痉挛。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.28 US 62/314,1281.一种治疗受试者痉挛的方法，包括上调GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因，从而治疗受试者的痉挛。2.权利要求1所述的方法，其中，所述GAD65基因和VGAT基因的上调是所述GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调。3.权利要求1所述的方法，其中，所述GAD65基因和VGAT基因的上调包括向受试者施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而降低痉挛。4.权利要求3所述的方法，其中，所述GAD65和VGAT过表达。5.权利要求3所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体、腺病毒载体(AV)或腺相关载体(AAV)。6.权利要求5所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体。7.权利要求5所述的方法，其中，所述载体是AAV。8.权利要求7所述的方法，其中，所述AAV是AAV9。9.权利要求3所述的方法，其中，所述病毒载体直接施用至所述受试者的脊髓实质至所述受试者的鞘内空间、至所述受试者的脊髓软膜下空间或至所述受试者的外周痉挛肌肉。10.一种治疗受试者痉挛的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的病毒载体，所述病毒载体包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸，从而治疗受试者的痉挛。11.权利要求10所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体、AV或AAV。12...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·马尔萨拉，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US