一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、产气肠杆菌Cad基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明专利技术通过提取产气肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中产气肠杆菌含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断产气肠杆菌活性菌的含量以及后续研究泌尿道感染具有重要意义。

A Real-time Fluorescence Quantitative PCR Kit for Detection of Enterobacter Aerogenicum

The present invention relates to a real-time fluorescent quantitative PCR kit for detection of Enterobacter aerogenes, including a PCR reaction solution, an enzyme mixture solution, a Cad gene standard of Enterobacter aerogenes, a negative reference substance and a positive reference substance. By extracting the genomic DNA of Enterobacter aerogenes and combining with real-time fluorescence quantitative PCR detection technology, the method can accurately quantify the content of Enterobacter aerogenes in the samples to be tested. It has the characteristics of rapidity, sensitivity and specificity, and is very important for judging the content of Enterobacter aerogenes active bacteria and subsequent research on urinary tract infection. Meaning.

【技术实现步骤摘要】
一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和微生物检测
，尤其涉及一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes，EAE）属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，是一种条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，可引起呼吸道、泌尿生殖道、血液等感染，也是老年人感染或院内获得性肺炎的常见致病菌。产气肠杆菌可以产生B一内酰胺酶，多年来由于抗生素的滥用，该类细菌引起医院感染的概率不断上升，已成为院内感染常见的条件致病菌。传统的诊断产气肠杆菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。TaqManFAM探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于产气肠杆菌的快速检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。为解决上述问题，本专利技术所述的一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGCTGTACGCTTCATCTATT-3'；下游引物序列为5'-GACGCTGTATGCCGAGGTT-3'；探针序列为5’-TTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTT-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—产气肠杆菌Cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中Cad基因标准品序列为5’-CGCTGTACGCTTCATCTATTTTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTTTTATCTGGTAGAAAATCGCCATATCTTTAATGCCGGGCATTTTACCTACTTTTTCAACCTCGGCATACAGCGTC-3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。所述上游引物和所述下游引物为包括引物序列的互补链序列。所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ、DABCYL、TAMRA中的一种。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术采用基因克隆技术，将产气肠杆菌Cad基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有Cad基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据产气肠杆菌Cad基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。2、本专利技术通过提取产气肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中产气肠杆菌含量的目的，对判断产气肠杆菌活性菌的含量以及后续研究泌尿道感染具有重要意义。3、本专利技术快速、灵敏、特异性好。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本专利技术灵敏度实验结果。a代表质粒浓度分别为1.00×109copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×108copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、h代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照。图2为本专利技术探针特异性实验结果。其中a标准扩增曲线的为产气肠杆菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线分别为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照。图3为本专利技术产气肠杆菌凝胶成像电泳图。从左到右依次为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、DL2000的Marker、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、产气肠杆菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照。图4为本专利技术产气肠杆菌标准曲线。具体实施方式一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGCTGTACGCTTCATCTATT-3'；下游引物序列为5'-GACGCTGTATGCCGAGGTT-3'；探针序列为5’-TTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTT-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—产气肠杆菌Cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中Cad基因标准品序列为5’-CGCTGTACGCTTCATCTATTTTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTTTTATCTGGTAGAAAATCGCCATATCTTTAATGCCGGGCATTTTACCTACTTTTTCAACCTCGGCATACAGCGTC-3’（SEQIDNO.2）；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。其中：上游引物和下游引物可为包括引物序列的互补链序列。上游引物和下游引物也可为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mM Tris‑HCl、100mM KCl、0.12%Triton X‑100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl2、50nM dNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nM Taqman探针组成；其中上游引物序列为5'‑CGCTGTACGCTTCATCTATT‑3'；下游引物序列为5'‑GACGCTGTATGCCGAGGTT‑3'；探针序列为5’‑TTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTT‑3’；—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris‑HCl，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween®20和0.5% NP‑40组成；—产气肠杆菌Cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml的重组质粒组成；其中Cad基因标准品序列为5’‑CGCTGTACGCTTCATCTATTTTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTTTTATCTGGTAGAAAATCGCCATATCTTTAATGCCGGGCATTTTACCTACTTTTTCAACCTCGGCATACAGCGTC‑3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。...

【技术特征摘要】
2017.12.01 CN 20171125238461.一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGCTGTACGCTTCATCTATT-3'；下游引物序列为5'-GACGCTGTATGCCGAGGTT-3'；探针序列为5’-TTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTT-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—产气肠杆菌Cad基因标准品，由1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，沈颂东，李亚鹏，高恺，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32