一种染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法技术

本发明专利技术公开一种染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法。包括以环状RNA hsa_circ_0051778拷贝数作为检测指标在肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别试剂盒中的应用，依据环状RNA hsa_circ_0051778在结核性胸膜炎中的拷贝数高于在肺腺癌中的拷贝数；其中，试剂盒包括环状RNA hsa_circ_0051778特异性引物、阳性对照、阴性对照、染料法数字PCR专用PCR扩增预混液及无菌去离子水；通过取样、PCR扩增体系配制、扩增反应及鉴别步骤，进行本试剂盒的使用。从而准确、快速鉴别肺腺癌与结核性胸膜炎，检测结果表明：该检测工具的灵敏度可达90%以上左右，高于目前临床使用的单一方法。

A Dye-based Digital Quantitative PCR Kit and Its Application and Application

The invention discloses a dye method digital quantitative PCR kit and its application and use method. Using the number of copies of cyclic RNA hsa_circ_0051778 as detection index in the differential kit between lung adenocarcinoma and tuberculous pleurisy, the number of copies of cyclic RNA hsa_circ_0051778 in tuberculous pleurisy was higher than that in lung adenocarcinoma, and the kit included specific primers of cyclic RNA hsa_circ_0051778. Positive control, negative control, dye-specific pre-mixtures for digital PCR and sterile deionized water; the kit was used through sampling, preparation of PCR amplification system, amplification reaction and identification steps. The results show that the sensitivity of the detection tool can reach more than 90%, which is higher than the single method currently used in clinic.

【技术实现步骤摘要】
一种染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法
本专利技术涉及一种染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法，尤其涉及一种基于环状RNAhsa_circ_0051778为检测指标的染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法，属于医用检测工具。
技术介绍
肺腺癌和结核性胸膜炎均是临床常见的呼吸系统疾病，而两种疾病的一些临床表现较为相似，但其治疗方案和预后却有明显不同，因此，准确地诊断这两种疾病对于患者的预后极为重要。胸腔积液即胸水，是指机体受到某些疾病影响胸膜后所导致的胸腔液体异常增多。肺腺癌和结核性胸膜炎是引发胸水的常见病因，目前，可通过检测胸水中的结核杆菌或者肿瘤细胞而确诊，但该确诊在临床上还将通过病史、血液检测、胸水生化检测、血沉检测、结核抗体检测、细胞染色体检测、肿瘤抗原检测等对两者进行鉴别诊断，鉴别过程较为繁琐，耗时，也增加患者的经济负担，故而实际临床工作中阳性检测率较低。
技术实现思路
专利技术人在长期的研究中发现，胸水外泌体中的环状RNAhsa_circ_0051778在结核性胸膜炎中的表达较肺腺癌高约10倍，因此，基于这一研究结果，环状RNAhsa_circ_0051778可作为肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别的诊断指标并应用于检测试剂盒中。本专利技术旨在克服现有技术问题，而提出了一种染料法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法。该试剂盒以胸水外泌体中的环状RNAhsa_circ_0051778为检测指标，结合染色法，并通过数字定量PCR仪定量检测环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数，从而准确的鉴别肺腺癌与结核性胸膜炎，完成疾病确诊和治疗的前期工作。为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：本专利技术首次将环状RNAhsa_circ_0051778作为检测指标，特定的应用于肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别的染料法数字定量PCR试剂盒中，通过定量检测胸水外泌体样本中的环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数，而作为肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别的依据。所述试剂盒以通过检测胸水外泌体样本中的环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数作为检测指示；若胸水外泌体样本中的环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数大于4.1拷贝/孔，则判断该患者为结核性胸膜炎患者，反之，该患者为肺腺癌患者。所述试剂盒包括特异性引物，特异性引物为环状RNAhsa_circ_0051778特异性引物，其中，包括前引物序列为5’-GATCTCTCCGTTCTCAGGCC-3’，以及后引物序列为5’-GAGAATGACGAACAGGAGCG-3’；此外，所述试剂盒包括阳性对照，阳性对照为cDNA，cDNA由肺腺癌患者胸水外泌体中的RNA逆转录而成，在逆转录过程中，RNA逆转录采用的引物为随机六聚体引物，其中，RNA纯度A260/A280为1.4～2.1；优选的，RNA纯度A260/A280为1.9～2.1。该阳性对照的设置，用于验证PCR扩增体系扩增反应等步骤的可行性；此外，所述试剂盒还包括阴性对照，阴性对照为无菌去离子水。阳性对照与阴性对照结合，排除PCR扩增体系扩增反应等步骤中其他干扰情况；此外，所述试剂盒还包括PCR扩增预混液QX200ddPCREvaGreenSupermix。一种染料法数字定量PCR试剂盒的使用方法，包括如下步骤：A．取样于患者胸水外泌体中取200ng～1µgRNA，进行逆转录反应，得样本cDNA；B．PCR扩增体系配制PCR扩增体系为20µL，包括前引物序列、后引物序列、样本cDNA、2×QX200ddPCREvaGreenSupermix和无菌去离子水，其中，前引物序列和后引物序列终浓度均为100nM，样本cDNA1µL，2×QX200ddPCREvaGreenSupermix为10µL，其余为无菌去离子水；C．扩增反应将步骤B所得的PCR扩增体系在扩增条件下进行扩增反应，扩增条件为：在95℃条件下预变性5min；然后40个循环，其中，包括依次在95℃条件下变性30s，在60℃条件下退火和延伸1min，在4℃条件下保持5min，在90℃条件下保持5min稳定信号；D．拷贝数测定对步骤C所得扩增产物环状RNAhsa_circ_0051778进行定量检测，得环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数；E．鉴别将步骤D所得的环状RNAhsa_circ_0051778的拷贝数与参考值4.1拷贝/孔进行比较；若前者大于后者，则判断该患者为结核性胸膜炎患者；反之，则该患者为肺腺癌患者。优选的，在步骤A中，所述RNA纯度A260/A280为1.4～2.1。优选的，在步骤A中，所述RNA纯度A260/A280为1.9～2.1。优选的，在步骤A中，所述RNA逆转录采用的引物为随机六聚体引物。优选的，在步骤A中，RNA为1µg。采用本技术方案，带来的有益技术效果为：1）本专利技术首次将环状RNAhsa_circ_0051778作为检测指标，并通过大量实验对此进行了验证：通过定量测定环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数并与参考值进行比较，为快速、精准的鉴别肺腺癌和结核性胸膜炎提供了一种新检测指标的新型检测工具；2）本专利技术提供的染料法数字定量PCR试剂盒用于鉴别肺腺癌和结核性胸膜炎，准确度较高，可达90%以上，远高于目前临床上所使用的单一方法；3）本专利技术提供的染料法数字定量PCR试剂盒检测通量较高，仅需6小时即可判断96个待测样本的来源，检测一个样本仅需约6min，极大提高诊疗效率；4）本专利技术提供的检测试剂盒成本较低，每个样本仅需人民币100元左右，极大降低了患者的费用；5）本专利技术提供的检测试剂盒通过拷贝数即可直接判断待测样本的来源，设计原理合理，结果判断较容易，不需要专业培训。具体实施方式下面通过对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。染料法数字定量PCR试剂盒在使用过程中，拷贝数参考值4.1拷贝/孔由以下方式得出：首先，取样：取50例胸水样本（其中，25例来自肺腺癌患者，25例来自结核性胸膜炎患者）中1µgRNA，进行逆转录反应，分别得cDNA；其次，PCR扩增体系配制：包括前引物序列、后引物序列、cDNA、2×QX200ddPCREvaGreenSupermix和无菌去离子水，PCR扩增体系为20µL，其中，前引物序列和后引物序列终浓度均为100nM，样本cDNA1µL，2×QX200ddPCREvaGreenSupermix为10µL，其余为无菌去离子水；再次，扩增反应：上述PCR扩增体系分别在扩增条件下进行扩增反应，扩增条件为：在95℃条件下预变性5min；然后40个循环，其中，包括依次在95℃条件下变性30s，在60℃条件下退火和延伸1min，在4℃条件下保持5min，在90℃条件下保持5min稳定信号；最后，拷贝数测定：分别检测扩增反应所得的胸水外泌体中环状RNAhsa_circ_0051778的拷贝数，结果显示：胸水外泌体中环状RNAhsa_circ_0051778的拷贝数均值为14.00，标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环状RNA hsa_circ_0051778作为检测指标在制备肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别的染料法数字定量PCR试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.环状RNAhsa_circ_0051778作为检测指标在制备肺腺癌与结核性胸膜炎鉴别的染料法数字定量PCR试剂盒中的应用。2.一种根据权利要求1所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以通过检测胸水外泌体样本中的环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数作为检测指示；若胸水外泌体样本中的环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数大于4.1拷贝/孔，则判断该患者为结核性胸膜炎患者，反之，该患者为肺腺癌患者。3.根据权利要求2所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括环状RNAhsa_circ_0051778特异性引物、阳性对照、阴性对照和PCR扩增预混液，其中，阴性对照为无菌去离子水。4.根据权利要求3所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，环状RNAhsa_circ_0051778特异性引物，包括前引物序列为5’-GATCTCTCCGTTCTCAGGCC-3’，以及后引物序列为5’-GAGAATGACGAACAGGAGCG-3’。5.根据权利要求3所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为由肺腺癌患者胸水外泌体中的RNA逆转录而成的cDNA。6.根据权利要求5所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，所述RNA逆转录采用的引物为随机六聚体引物。7.根据权利要求3所述的染料法数字定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增预混液为QX200ddPCREvaGreenSupermix。8.一种根据权利要求2-7中任意一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳云，张林，车光璐，农雪萍，黄建华，罗海玻，周斌，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：四川,51