一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用制造技术

技术编号:19548189 阅读:26 留言:0更新日期:2018-11-24 21:22
本发明专利技术属于生物医学技术领域,涉及一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体序列为5’‑AAGGAGCAGCGTGGAGG ATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT‑3’。本发明专利技术所述核酸适配体具有高特异性、高亲和力以及良好的血浆稳定性,在4℃,25℃,37℃均能保持良好活性。本发明专利技术所述核酸适配体可作为分子探针,对转移性乳腺癌细胞进行特异性成像和检测;可作为捕获探针,进行外周血循环肿瘤细胞的特异性捕获分析。在乳腺癌转移的预测和诊治方面具有良好的应用前景。

A nucleic acid aptamer targeting metastatic human breast cancer cells and its application

The invention belongs to the field of biomedical technology, and relates to a nucleic acid adapter targeting metastatic human breast cancer cells and its application. The nucleic acid aptamer sequence is 5'AAGGAGCAGGGTGGAGG ATATACACCGTCATCAGGAGGAGCATCTAGTCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTCGTGGT 3'. The nucleic acid adapter of the invention has high specificity, high affinity and good plasma stability, and can maintain good activity at 4, 25 and 37 degrees Celsius. The nucleic acid adapter can be used as a molecular probe for specific imaging and detection of metastatic breast cancer cells and as a capture probe for specific capture and analysis of circulating tumor cells in peripheral blood. It has good application prospects in the prediction and diagnosis of breast cancer metastasis.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用
本专利技术属于生物医学
,涉及一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用。
技术介绍
乳腺癌是高发的女性恶性肿瘤,转移是患者致死的主要原因。发展高灵敏度、高特异性的分子探针,对于准确预测乳腺癌的转移和复发,进而改善治疗的有效性,提高患者的生存率具有重要意义。核酸适配体(aptamer)是采用指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment,SELEX)从大容量RNA/单链DNA随机文库中筛选得到的能与靶标物质特异性结合的寡核苷酸序列,被称为化学抗体。与传统的抗体相比,具有特异性强,亲和力高,稳定性好,易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。消减Cell-SELEX是以完整细胞作为靶标进行核酸适配体筛选的技术,由于使用具有功能表型差异的靶细胞和非靶细胞进行消减筛选,可获得针对特定功能表型细胞的核酸适配体。由于筛选出的核酸适配子主要与细胞表面分子结合,特别适合用来制备分子探针进行靶细胞的特异性捕获、成像分析以及作为靶向载体等。有研究将低分化细胞与高分化细胞进行消减筛选,得到能与低分化细胞特异性结合的核酸适配体;有研究将病毒感染细胞与非感染细胞进行消减筛选,制备了可以特异性检测病毒感染的核酸适配子分子探针。但目前未见以转移性乳腺癌细胞为靶细胞,以非转移性乳腺癌细胞为非靶细胞,筛选转移性人乳腺癌细胞特异性核酸适配体的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种以转移性人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞,以非转移性人乳腺癌细胞MCF7为非靶细胞,经过消减Cell-SELEX技术筛选得到的能够与转移性人乳腺癌细胞特异性结合的核酸适配体,可以制备成分子探针进行转移性人乳腺癌细胞的靶向成像以及循环肿瘤细胞的捕获等应用。本专利技术采用如下技术方案:一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体,所述核酸适配体序列为:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’(SEQIDNo.1)。进一步的,本专利技术提供所述核酸适配体的应用:所述的核酸适配体在转移性人乳腺癌细胞特异性成像中的应用,可作为制备转移性人乳腺癌细胞特异性成像的分子探针使用。所述的核酸适配体在特异性捕获外周血循环肿瘤细胞中的应用,可作为制备捕获外周血循环肿瘤细胞的分子探针使用,所述肿瘤包括乳腺癌、转移性乳腺癌。所述的核酸适配体在鉴定核酸适配体靶标中的应用,可作为制备鉴定所述核酸适配体靶标的试剂或试剂盒中使用。与现有技术相比,本专利技术的有益效果为:1.提供了一种新的能够靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体序列。所述核酸适配体具有高亲和力和高特异性:对靶细胞的解离常数Kd值为纳摩尔级(45.6±1.2nM);对靶细胞及其它转移性人乳腺癌细胞结合能力强,对非靶细胞及其它非转移性乳腺癌细胞结合能力弱或不结合,对正常细胞不结合。2.由于识别的靶标为细胞表面分子,并对靶细胞的结合具有高亲和力和高特异性,以及良好的血浆稳定性,所述核酸适配体特别适合作为捕获探针进行外周血中循环肿瘤细胞的特异性捕获。采用基于所述核酸适配体建立的捕获系统进行乳腺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的捕获,结果显示了明显的转移特异性,细胞捕获数量及阳性捕获率为远端转移>淋巴结转移>非转移。对比分析显示,该系统的特异性明显优于广泛使用的基于EpCAM作为靶标的捕获系统。附图说明图1为实施例1中流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性结合结果。图2为实施例2中荧光显微技术分析所述核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231的特异性结合结果。图3为实施例3中流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的解离常数结果。图4为实施例5中流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性结果。图5为实施例6中酶处理实验分析所述核酸适配体所识别的靶标性质结果。图6为实施例7中琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分析所述核酸适配体血浆稳定性结果。图7为实施例8中所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性捕获结果。图8为实施例9中所述核酸适配体捕获临床血样中的循环肿瘤细胞结果。具体实施方式制备一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体,所述核酸适配体序列为:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’(SEQIDNo.1)。实施例1流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性结合。分别取处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液,1000rpm离心5min后去上清,用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。然后加入含250nM核酸适配体的结合缓冲液200µl,于4℃摇床上轻摇孵育30min,1000rpm离心5min后去上清,用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。最后加入300µlPBS用于流式细胞仪检测,随机文库序列作为对照。核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231和反筛细胞MCF-7的流式细胞仪检测结果如图1所示,核酸适配体能与靶细胞MDA-MB-231稳定结合,而不能与反筛细胞有效结合,说明所述的核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性。实施例2荧光显微技术分析所述核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231的特异性结合。将人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7分别培养于共聚焦培养皿中。培养24h后,吸尽培养皿中的所有液体,用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次,然后将含有250nM生物素标记核酸适配体的结合缓冲液与上述两种细胞在4℃条件下轻摇孵育30min。孵育后,吸尽培养皿中的所有液体,用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次,然后加入量子点标记的链霉亲和素QD-SA,室温中孵育15min。孵育后,吸尽培养皿中的所有液体,用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次,最后加入300µlPBS用于检测,随机文库序列作为对照,结果如图2所示。共聚焦荧光显微镜下观察显示,MDA-MB-231细胞表面呈现明显的荧光,而MCF-7细胞表面未见荧光显示,提示所述核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性,具有作为分子探针进行靶细胞特异性成像的能力。实施例3流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的解离常数。合成并配制不同浓度的所述核酸适配体,分别与等量的靶细胞进行孵育,依实施例1操作分别进行流式细胞术检测,测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标,相应的荧光强度值为纵坐标,按照公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合曲线,得到核酸适配体的解离曲线,如图3所示。由解离曲线得到的核酸适配体的解离常数Kd为45.6±1.2nM。结果表明:所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231具有高亲和结合特性。实施例4流式细胞术检测所述核酸适配体对不同细胞的结合选择性。取处于对数生长期的不同种类细胞系,包括肿瘤细胞系MDA-MB-231,MCF7,SK-BR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体序列为:5’‑AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT‑3’( SEQ ID No.1)。

【技术特征摘要】
1.一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体序列为:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’(SEQIDNo.1)...

【专利技术属性】
技术研发人员:方瑾李婉明周琳琳
申请(专利权)人:中国医科大学
类型:发明
国别省市:辽宁,21

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