一种白蚁抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种白蚁抗菌肽及其应用。该抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其分子量为2472道尔顿。本发明专利技术提取得到的抗菌肽，具有分子量小、杀菌作用强等优点，此外还具有对人的正常细胞毒性小的特点。

A Termite Antimicrobial Peptide and Its Application

The invention discloses a termite antimicrobial peptide and its application. The amino acid sequence of the antimicrobial peptide is shown as SEQ ID NO.1, and its molecular weight is 2472 Dalton. The antimicrobial peptide extracted by the invention has the advantages of small molecular weight, strong bactericidal effect, and small normal cytotoxicity to human beings.

【技术实现步骤摘要】
一种白蚁抗菌肽及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种白蚁抗菌肽及其应用。
技术介绍
抗菌肽是当生物受到微生物侵入后机体迅速产生的高效、广谱的抗菌肽类分子，来参与机体的免疫反应。一般由12到100个氨基酸组成，大小从几kDa到十几kDa不等。抗菌肽作为机体有效的防御分子是广泛存在的，目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽。抗菌肽在合成机制、氨基酸组成和作用机制等方面不同于传统的微生物(包括细菌、真菌和链霉菌等)产生的抗生素。抗菌肽不仅具有广谱的抗菌活性，其在抗病毒、抗真菌、抗寄生虫以及抗肿瘤等方面也表现出较高的生物活性。抗菌肽抗菌机理复杂，但大多数理论都认为其机制涉及到抗菌肽的阳离子性和疏水性与带负电荷的微生物胞膜的作用，抗菌肽和细菌的细胞膜接触后，引起膜通透性改变，或在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，最后导致细菌内容物外泄而死亡。因此，抗菌肽在杀灭细菌的速度上要远远高于传统的抗生素，且不像抗生素在低浓度下抑制细菌的生长，抗菌肽对细菌的作用几乎都是致死性的。目前为止，已经从白蚁中提取出来了多种抗菌肽，但仍有许多种类的抗菌肽尚未被发现。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种白蚁抗菌肽及其应用，本专利技术在白蚁中提取得到一种全新的，未见报道的抗菌肽，并对其抑菌性能进行了研究。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种白蚁抗菌肽，该抗菌肽含有22个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其分子量为2472道尔顿。上述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸后，与其差异在10％以内，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。上述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸后序列如下：GLGNIPWGKVKEDFLVGGMKAR-NH2；(SEQIDNO.2)RLGNIPWGKVKEDFLVGGMKAV-NH2；(SEQIDNO.3)RLGNIPWGKVKDFLVGGMKAR-NH2；(SEQIDNO.4)RLGNIPWGKVKEDFLVGGMKARV-NH2；(SEQIDNO.5)RLGNIPWGKVKEDFLVGGMPKAV-NH2；(SEQIDNO.6)上述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。上述抗菌肽在制备抑制大肠埃希氏杆菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌药物中的应用。进一步地，抗菌肽对大肠埃希氏杆菌的最小抑菌浓度为16.3mg/L，对肺炎克雷伯杆菌的最小抑菌浓度为19.6mg/L。上述抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提取的抗菌肽，具有分子量小、杀菌作用强等优点，此外还具有对人的正常细胞毒性小的特点。附图说明图1为抗菌肽抑菌效果图；其中，图1a为大肠埃希氏杆菌抑菌图；图1b为肺炎克雷伯杆菌抑菌图；图2为抗菌肽抑菌最小抑菌浓度效果图；其中，图2a为大肠埃希氏杆菌抑菌图；图2b为肺炎克雷伯杆菌抑菌图；图3为抗菌肽一级质谱测试图。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1抗菌肽的提取1、制备白蚁样品白蚁样品干燥后，取5～10g样品，用电粉碎机粉碎，备用。2、脱脂处理将制备得到的白蚁粉末用滤纸筒包好，再放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在65℃热水中，水浴加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，提取6-12h，再将滤纸筒内样品在50℃的条件下充分干燥。3、乙醇浸提按料液比为1:30的比例，向步骤2制备得到的产物中加入60％乙醇，在4℃的条件下浸提24h，过滤，然后在4℃，6000～7000r/min的条件下，离心浸提液20min，并收集上清液。4、旋转蒸馏旋转蒸发步骤3收集的上清液，挥干乙醇，即可制备得到白蚁粗提液。5、柱层析以交联葡聚糖SephadexG-25为填充物，填充至层析柱中，并进行柱平衡，平衡完毕后，以浓度为0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液为洗脱液，对白蚁粗提液进行柱层析分离，洗脱体积为2～3个柱体积，洗脱过程中，每管洗脱液的收集时间为15min，体积为3～5mL，并进行编号。6、抗菌肽的筛选用收集得到的洗脱液进行抑菌实验，以大肠埃希氏杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、枯草芽孢杆菌(ATCC11060)、肺炎克雷伯杆菌(KlebsiellapneumoniaestrainWL1309)等细菌为测试菌，采用牛津杯法进行抑菌实验，重复3次，并计算抑菌圈直径的平均值；并挑选出具有抑菌作用的洗脱液，浓缩，得到白蚁抗菌肽提纯物。7、抗菌肽的保存将白蚁抗菌肽物质置于-20℃的条件下，可保存3～6个月。8、抗菌肽的序列测定通对分离得到的抗菌肽进行测序，采用色谱法确定了抗菌肽的序列结构，其氨基酸序列为：RLGNIPWGKVKEDFLVGGMKAR-NH2(SEQIDNO.1)，即该抗菌肽序氨基酸列为：精氨酸(R)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)-天门冬氨酸(N)-异亮氨酸(I)-脯氨酸(P)-色氨酸(W)-甘氨酸(G)-赖氨酸(K)-缬氨酸(V)-赖氨酸(K)-谷氨酸(E)-天冬氨酸(D)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-缬氨酸(V)-甘氨酸(G)-甘氨酸(G)-甲硫氨酸(M)-赖氨酸(K)-丙氨酸(A)-精氨酸(R)-NH2；其分子量为2472道尔顿，并对该抗菌肽进行一级质谱检测，其结果见图3。实施例2抑菌效果检测采用牛津杯法检测其抑菌性，待测试菌为大肠埃希氏杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肺炎克雷伯杆菌(KlebsiellapneumoniaestrainWL1309)、肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、枯草芽孢杆菌(ATCC11060)做抑菌实验，用无菌移液枪吸取0.1mL已经制备好的菌悬液，分别加入到对应受试菌的培养基的固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，制成带菌平板(或用菌和温度适宜的培养基混匀做浇筑平板)，在无菌条件下，用镊子将灭菌牛津杯放入平板中，在实施例1提取得到的抗菌肽物质，检测其是否有抑菌圈(呈透明状)出现，其抑菌效果见图1，其中，图1a为大肠埃希氏杆菌抑菌图；图1b为肺炎克雷伯杆菌抑菌图。从图1a和图1b中能看到具有明显的抑菌圈出现，表明本专利技术方法提取得到的抗菌肽具有抑制革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌和肺炎克雷伯杆菌的效果；而金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌中均未出现抑菌圈，表明该抗菌肽对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌不具备抑制作用。实施例3最小抑菌浓度检测对实施例1提取得到的白蚁抗菌肽提纯物作不同递减浓度稀释，分别得到浓度为100mg/L、90mg/L、80mg/L、70mg/L、60mg/L、50mg/L、40mg/L、30mg/L、20mg/L以及10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白蚁抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其分子量为2472道尔顿。

【技术特征摘要】
1.一种白蚁抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其分子量为2472道尔顿。2.如权利要求1所述的白蚁抗菌肽，其特征在于，SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸后，与其差异在10％以内，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶新，刘军，殷建新，李仁奇，于川，喻勇，王志平，任桂君，林俊，杨洁，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：四川,51