一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，首次从皱瘤海鞘中提取、分离和鉴别出化合物肌苷，能够对皱瘤海鞘进行充分回收利用，避免浪费；采用高速逆流色谱进行分离，具有样品无损失、无污染、高效、快速和分离量大的优点，具体分离步骤简单易操作；分离得到的肌苷在制药等领域具有广泛用途，对海洋天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

A Method for Isolating Inosine from Styela plicata

The invention discloses a method for separating inosine from Styela plicata, which extracts, separates and identifies inosine compounds from Styela plicata for the first time, can fully recover and utilize the Styela plicata and avoid waste, and adopts high-speed counter-current chromatography to separate the inosine with no loss of samples, no pollution, high efficiency, fast and separation. The advantages of large amount of inosine are that the specific separation steps are simple and easy to operate. The isolated inosine is widely used in pharmaceuticals and other fields, and it is of great significance to the study of the effective components of marine natural products.

【技术实现步骤摘要】
一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法
本专利技术涉及生物来源的新药物提取分离工艺
，具体涉及一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，首次从皱瘤海鞘(Styelaplicata)中提取、分离和鉴别出化合物肌苷。
技术介绍
海鞘是尾索动物亚门海鞘纲的尾索动物，在自然界中已知有1500余种，主要分布在热带及亚热带海域。我国海鞘资源丰富，已记录的中国沿海海鞘种类有100余种，且有很多为我国所特有。一般而言，海鞘可为自珊瑚礁海域采集到的野生型﹝wildtype﹞，亦可为经养殖得到的养殖型﹝culturedtype﹞。据报道，海鞘中含有多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合物，因此，近年来，海鞘的化学成分及其生物活性成为了海洋天然产物研究的热门领域。皱瘤海鞘(Styelaplicata)是海鞘中的一种，主要分布于我国中南沿海的福建、广东和海南等，部分地区也有人工养殖。皱瘤海鞘经常在一些海产养殖过程中一同生长起来，虽然皱瘤海鞘在部分地区有作为食物食用的习惯，但大部分的皱瘤海鞘仍然是作为养殖过程中的副产物被丢弃掉，造成了大量的浪费。因此，如果能将皱瘤海鞘进行有效的利用，不仅具有一定的经济价值，也可以解决浪费问题。肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等，化学结构式如下式所示，分子式为C10H12N4O5，相对分子量为268。肌苷是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物。在嘌呤的从头合成(denovosynthesis)中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体。适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外尚可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。目前尚未有研究揭示皱瘤海鞘中是否含有肌苷，更没有如何从皱瘤海鞘中获得肌苷的分离技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，包括：1)取皱瘤海鞘，用正己醇浸提若干次，合并浸提液，浓缩得到粗提物；2)步骤1)得到的粗提物用高速逆流液相色谱分离：溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝4.5～5.5:0.8～1.2:4.5～5.5，充分混合后静置分层，然后分离上相与下相；所述粗提物用45～55％甲醇溶解为浓度680～700mg/mL进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长：205～215nm；收集55～83min出峰对应的组份；3)取步骤2)中55～83min出峰对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇-水混合液；梯度洗脱1.5～2.5h，流动相中甲醇浓度从4～6％均匀递增到100％；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长195～205nm、250～260nm、305～315nm；4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为13％～25％时对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇浓度为30～34％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长210～220nm、250～260nm、330～340nm；5)收集步骤4)中7～11min出峰对应的组份，用0.5～2％甲醇水配制成140～160mg/mL，用高效液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇浓度为0.5～2％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速：8～12mL/min；柱温24～26℃；检测波长：195～205nm、245～255nm和255～265nm；收集66～75min出峰对应的组份，即为肌苷。一实施例中：所述步骤2)中，高速逆流液相色谱采用TBE-300B。一实施例中：所述步骤2)中，上样体积为14～16mL。一实施例中：所述步骤2)中，以上相为固定相，以下相为流动相，用35～45mL/min的流速将固定相泵满，调节转速为800～900r/min，温度34～36℃，以2～4mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；随后再用于粗提物的高速逆流液相色谱分离。一实施例中：所述步骤3)中，反相液相色谱采用4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-TriartC18的规格为50×250mm，粒径10μm。一实施例中：所述步骤4)中，反相液相色谱采用4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-TriartC18的规格为50×250mm，粒径10μm。一实施例中：所述步骤5)中，高效液相色谱采用岛津高效液相色谱仪制备系统LC-6AD；固定相YMC-TriartC18制备柱的规格为20×250mm，粒径5μm。一实施例中：所述步骤5)中，采用SPD-M20A二级管阵列检测器。一实施例中：所述步骤5)中，进样量280～320μL。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：本专利技术以人工养殖的皱瘤海鞘为原料进行分离，原料易得，能够对皱瘤海鞘进行充分回收利用，避免浪费；采用高速逆流色谱(HSCCC)进行分离，具有样品无损失、无污染、高效、快速和分离量大的优点，且具体分离步骤简单易操作；所得的肌苷为首次从皱瘤海鞘(Styelaplicata)中提取、分离纯化得到，在作为白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化、中心视网膜炎、视神经萎缩等疾病的治疗或辅助治疗方面具有广泛用途，对于海洋天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷在1％甲醇洗脱时UPLC分析图谱。图2为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的MS图谱。图3为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的1H谱图。图4为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的13C谱图。具体实施方式下面通过实施例具体说明本专利技术的内容：1)将湿重10Kg皱瘤海鞘冻干后，切成碎片，以粉碎机打碎置于5000mL烧杯中，以正丁醇浸泡并用超声加速浸提，重复浸提若干次直至浸提液变淡至近无色后，合并浸提液，以旋转蒸发仪抽干溶剂，得到正丁醇层粗提物(qb)52g；2)取步骤1)得到的正丁醇层粗提物(qb)52g用75mL50％甲醇水溶解，使之浓度为693mg/mL，用高速逆流液相色谱(HSCCC)(TBE-300B)分离切段成4组分；分为五次上样，每次上样体积为15mL；高速逆流液相色谱系统TBE-300B；溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝5:1:5(V/V)，按比例将四种溶剂混合配制好，摇匀，超声30min使其充分混合，静置过夜使上下相充分饱和平衡，分层，分离上相与下相；开主机；以上相为固定相，以下相为流动相，用40mL/min的流速将固定相泵满聚四氟乙烯管，调节转速为850r/min，恒温水浴35℃，以3mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；计算分配系数K值为52.02％；取上述用50％甲醇水溶解的浓度为6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：包括：1)取皱瘤海鞘，用正己醇浸提若干次，合并浸提液，浓缩得到粗提物；2)步骤1)得到的粗提物用高速逆流液相色谱分离：溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝4.5～5.5:0.8～1.2:4.5～5.5，充分混合后静置分层，然后分离上相与下相；所述粗提物用45～55％甲醇溶解为浓度680～700mg/mL进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长：205～215nm；收集55～83min出峰对应的组份；3)取步骤2)中55～83min出峰对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC‑Triart C18；流动相：甲醇‑水混合液；梯度洗脱1.5～2.5h，流动相中甲醇浓度从4～6％均匀递增到100％；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长195～205nm、250～260nm、305～315nm；4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为13％～25％时对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC‑Triart C18；流动相：甲醇浓度为30～34％的甲醇‑水混合液；等度洗脱；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长210～220nm、250～260nm、330～340nm；5)收集步骤4)中7～11min出峰对应的组份，用0.5～2％甲醇水配制成140～160mg/mL，用高效液相色谱分离：固定相：YMC‑Triart C18；流动相：甲醇浓度为0.5～2％的甲醇‑水混合液；等度洗脱；流速：8～12mL/min；柱温24～26℃；检测波长：195～205nm、245～255nm和255～265nm；收集66～75min出峰对应的组份，即为肌苷。...

【技术特征摘要】
1.一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：包括：1)取皱瘤海鞘，用正己醇浸提若干次，合并浸提液，浓缩得到粗提物；2)步骤1)得到的粗提物用高速逆流液相色谱分离：溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝4.5～5.5:0.8～1.2:4.5～5.5，充分混合后静置分层，然后分离上相与下相；所述粗提物用45～55％甲醇溶解为浓度680～700mg/mL进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长：205～215nm；收集55～83min出峰对应的组份；3)取步骤2)中55～83min出峰对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇-水混合液；梯度洗脱1.5～2.5h，流动相中甲醇浓度从4～6％均匀递增到100％；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长195～205nm、250～260nm、305～315nm；4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为13％～25％时对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇浓度为30～34％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长210～220nm、250～260nm、330～340nm；5)收集步骤4)中7～11min出峰对应的组份，用0.5～2％甲醇水配制成140～160mg/mL，用高效液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇浓度为0.5～2％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速：8～12mL/min；柱温24～26℃；检测波长：195～205nm、245～255nm和255～265nm；收集66～75...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永轩，吴秀娜，李培铖，罗联忠，许莉，秦飞，陈丹，
申请(专利权)人：厦门医学院，
类型：发明
国别省市：福建,35