分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法技术

本发明专利技术提出了一种分离红霉素B的方法。该方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC‑HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾‑乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本发明专利技术实施例的方法，相比于现有技术，流动相无需调节pH值，节省了时间成本。根据本发明专利技术实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。

Separation of erythromycin B and preparation of erythromycin B reference substance

The invention provides a method for separating erythromycin B. The method includes: separating erythromycin samples by high performance liquid chromatography to obtain erythromycin B; the conditions for the separation are as follows: chromatographic column: DAC HB100, filler ACCHROM C18TDE (100*250mm, 10um); column temperature: room temperature; mobile phase: 0.01-0.02mol/L potassium hydrogen phosphate B. Nitrile, the volume ratio of 0.01 mol/L potassium hydrogen phosphate to acetonitrile is 50:50-50:55, and the potassium hydrogen phosphate is dissolved in water in advance; flow rate is 450-470 mL/min; isometric elution; detection wavelength is 215 nm. According to the method according to the embodiment of the present invention, compared with the existing technology, the mobile phase does not need to adjust the pH value and saves time and cost. The method according to the embodiment of the present invention can efficiently separate erythromycin B from erythromycin sample and lay a good foundation for the preparation of the reference substance of erythromycin B.

【技术实现步骤摘要】
分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法。
技术介绍
红霉素(Erythromycin,简称EM)是一种大环内酯类广谱抗生素。目前已知其中有六种异构体，分别为红霉素A，B，C，D，E和F，A为主要活性成分。红霉素B的理化性质及抗菌谱与红霉素A相似，但抗菌活性却只有红霉素A的30％～60％。高纯度的红霉素组分对照品对于红霉素的研究工作有着十分重要的意义。而红霉素A与红霉素B的性质相似，一般的分离手段很难将其分离开来。现有的红霉素B对照品的纯化技术主要为专利CN102924547A所提及的纯化方法，该方法主要采用高效液相色谱仪将红霉素B从红霉素样品分离洗脱出来，再将洗脱液pH调为酸性，加入醋酸丁酯萃取，取水相，然后将水相pH调为碱性，用氯仿萃取，取氯仿层，氯仿层再用纯水洗两次，收集氯仿层，蒸干，得到红霉素B，但该方法的纯度最高只有93.4％。而欧洲药典委员会出售的红霉素B对照品，但价格非常昂贵，不利于普及使用。因此，红霉素B对照品的纯化方法仍有待开发和改进。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：专利CN102924547A所提及的纯化方法步骤繁琐，采用两次萃取，时间成本较高，而且红霉素B为弱极性化合物，水溶性较差，第一步在酸性体系下萃取，红霉素B回收率低，且产品纯度达不到欧洲药典委员会对杂质对照品纯度要求(95％以上)，另外专利实施案例中采用高效液相色谱分离洗脱上样量只有0.1g/针，效率极其低下。基于专利技术人对现有技术问题的发现和认识，专利技术人提出了一种改良的红霉素B对照品的制备方法，该方法能够高效、低成本地制备获得纯度95％以上的红霉素B对照品。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种分离红霉素B的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROMC18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L～0.02mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本专利技术实施例的方法中流动相采用0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾，其pH约为9.2左右，而红霉素样品本身为碱性化合物，因此，流动相无需调节pH即可用于红霉素样品的分离，相比于现有技术，节省了时间成本。并且专利技术人发现，该流动相很好的缓冲能力可以使得红霉素样品中各被分离的物质具有良好的峰形，利用该方法还可以实现较高的上样量，根据本专利技术实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％。进而，利用根据本专利技术实施例的方法，红霉素B的收率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述红霉素样品预先进行溶解和过滤处理。进而可将红霉素样品中干扰红霉素B分离纯化的杂质去除，红霉素B的收率会进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述红霉素样品预先溶于甲醇中，浓度为1g/mL。专利技术人发现，红霉素样品在甲醇中的溶解度高，同时红霉素样品在甲醇中的饱和浓度为1g/mL，因此，将红霉素样品以饱和浓度溶解在甲醇中，可最大限度地提高目标产物-红霉素B的分离效率。根据本专利技术的实施例，所述过滤处理是将溶解后的红霉素样品经过0.45μm的有机滤膜进行的。进而红霉素样品中未溶解的杂质或直径大于0.45μm的杂质被过滤去除，所得滤液进一步用于高效液相色谱分离，红霉素B的收率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述红霉素样品的上样量为20mL。专利技术人发现，在此上样量下，可最大限度地提高目标产物-红霉素B的分离效率。根据本专利技术实施例的分离方法，相比于现有技术，实现了红霉素B克级别的分离和制备，红霉素B的分离效率显著提高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种制备红霉素B对照品的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1)利用前面所述的方法从红霉素样品中分离红霉素B；2)将步骤1)获得的红霉素B进行一次萃取处理；3)将萃取产物进行重结晶处理，以便获得所述红霉素B对照品。相比于现有技术，根据本专利技术实施例的制备红霉素B对照品的方法，液相色谱分析中，流动相无需调节pH，节省了时间成本，经液相色谱洗脱后，洗脱液无需再调节pH，只需采用一次萃取，避免了多次萃取导致产品收率低下的问题，并且方法的最后一步增加重结晶处理过程，制备获得红霉素B对照品的纯度可高达95％以上。利用根据本专利技术实施例的方法，实现了高效、低成本地制备获得纯度95％以上，甚至高达98％的红霉素B对照品的技术目标。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述萃取处理是通过将所述步骤1)获得的红霉素B与二氯甲烷进行接触进行的。红霉素B为弱极性化合物，专利技术人发现，采用二氯甲烷进行一次萃取，二氯甲烷相比于其他萃取溶剂的用量少，且红霉素B的回收率显著提高。根据本专利技术的实施例，所述步骤1)获得的红霉素B是以含有红霉素B的流分的形式存在的，所述红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL。专利技术人发现，红霉素B的流分与二氯甲烷的体积比在上述范围内，红霉素B的回收率进一步提高。根据本专利技术的实施例，萃取处理后进一步包括将萃取处理产物的有机层进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品。根据本专利技术的具体实施例，所述旋转蒸干处理是在40℃～45℃的条件下进行的。在40℃～45℃的条件下，二氯甲烷能够快速挥发，而不破坏红霉素B的结构和活性，进而获得的红霉素B粗品用于后续进一步的重结晶处理，获得红霉素B的纯度会进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述重结晶处理是通过如下方式进行的：将所述萃取产物溶解在乙醇溶液中；以及将溶解在乙醇溶液中的萃取产物进行析出处理，析出产物构成所述红霉素B对照品。专利技术人发现，采用乙醇溶液进行重结晶处理，可以在较高温度下溶解多量的红霉素B，而在较低温度下，只能溶解极少量的红霉素B，红霉素B对照品经过乙醇重结晶处理后，其纯度显著提高。根据本专利技术的实施例，所述乙醇溶液的浓度为70％～80％。专利技术人发现，乙醇溶液的浓度在70％～80％范围内，红霉素B具有适宜的溶解度且重结晶回收率高，可达80％以上，而乙醇浓度超过80％，红霉素B的溶解度相对较高而重结晶回收率会有所降低。根据本专利技术的实施例，将所述萃取产物溶解在70℃～80℃的所述乙醇溶液中；以及将溶解在乙醇溶液中的萃取产物在0℃～5℃的条件下进行析出处理。专利技术人发现，萃取产物在上述温度条件下进行重结晶，红霉素B具有适宜的溶解度且重结晶效率进一步提高，红霉素B对照品产品纯度进一步提高，而乙醇溶液的温度低于70℃时，红霉素B的溶解度相对较低因此需要加大乙醇的用量来提高溶解红霉素B的量，反而导致最终B对照品产品的纯度有所降低。根据本专利技术的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离红霉素B的方法，其特征在于，包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC‑HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾‑乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。

【技术特征摘要】
1.一种分离红霉素B的方法，其特征在于，包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROMC18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品预先进行溶解和过滤处理；任选地，所述红霉素样品预先溶于甲醇中，浓度为1g/mL；任选地，所述过滤处理是将溶解后的红霉素样品经过0.45μm的有机滤膜进行的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品的上样量为20mL。5.一种制备红霉素B对照品的方法，其特征在于，1)利用权利要求1～4任一项所述的方法从红霉素样品中分离红霉素B；2)将步骤1)获得的红霉素B进行一次萃取处理；3)将萃取产物进行重结晶处理，以便获得所述红霉素B对照品。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取处理是通过将所述步骤1)获得的红霉素B与二氯甲烷进行接触进行的；任选地，所述步骤1)获得的红霉素B是以含有红霉素B的流分的形式存在的，所述红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL；任选地，萃取处理后进一步包括将萃取处理产物的有机层进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品；任选地，所述旋转蒸干处理是在40℃～45℃的条件下进行的。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重结晶处理是通过如下方式进行的：将所述萃取产物溶解在乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁桂挺，辛立波，刘国柱，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44