肿瘤标志物miRNA检测探针及检测芯片制造技术

本发明专利技术公开肿瘤标志物miRNA检测探针及检测芯片，其肿瘤标志物miRNA检测芯片，包括负载有纳米金属的基板，所述负载有纳米金属的基板连接有2‑3种信号分子，所述信号分子分属于按含有化学基团分类的活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子中的不同类；2‑3种信号分子中的任意1种连接抗体，其余1‑2种通过连接分子连接权利要求1肿瘤标志物miRNA检测探针。本发明专利技术的肿瘤标志物miRNA检测芯片可实现不同种类标志物蛋白质和核酸同时定量无干扰检测；利用纳应力传感，将不同种类标志物蛋白质和核酸的浓度信息转化为信号分子的特征峰位移量，从而检测不同种类标志物蛋白质和核酸的绝对浓度，检测准确性更高。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤标志物miRNA检测探针及检测芯片
本专利技术属于一种肿瘤标志物蛋白质和核酸的检测芯片及制备方法，特别是涉及一种肿瘤标志物蛋白质和核酸的定量且高灵敏同步检测探针及检测芯片。
技术介绍
肝癌是全球最致命的恶性肿瘤之一，死亡率与发病率之比大于95％。肝癌是一种临床症状迟发的癌症，外科手术切除或者肝移植又是目前为止唯一有效的治疗方式，故而肝癌的早期诊断就成为降低其死亡率与发病率之比的关键。肝癌典型标志物为甲胎蛋白(AFP),但是在早期疾病诊断阶段其表现出较低的灵敏度和特异性。尚有30％-40％的肝癌病人的AFP检测呈阴性，包括肝内胆管细胞癌(ICC)、高分化和低分化肝细胞癌(HCC)患者等，这样的患者会因为AFP的假阴性结果延误治疗。microRNA(miRNA)作为一种核酸类肿瘤标志物，其参与细胞增殖、凋零和分化，miRNA的异常表达与原发性肝癌(PLC)的发生和发展密切相关，再加上miRNA特异性好，在循环体液中稳定性高，使血清miRNA被认为是早期PLC的重要基因标志物。由于已经建立的AFP与肝癌之间的大量数据有助于进一步揭示miRNA与肝癌发生、发展之间的关系，因此不同种类血清标志物与AFP的联合检测对PLC的诊断和临床监测至关重要。例如，研究表明miR-223在HCC患者血清中呈低表达，但是在ICC中高表达，患者血清中的miR-223可以作为鉴别诊断HCC和ICC的特异标志物。因此，AFP与miR-223组合可以作为非常有力的二线诊断方案，在AFP检测阴性人群中早期筛查HCC和ICC。但是，miRNA具有尺寸小(19-24个碱基)，丰度低，序列同源性和易降解等特点，传统的检查方法很难做到定量检测。目前对miRNA的定量检测包括Northernblotting,qRT-PCR，荧光法，微阵列法，SERS法，但是其多数只局限于单独的microRNA检测，导致对microRNA检测并无参照。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)在核酸检测中应用较广，但由于miRNA的链长较短，引物设计困难，增加了实验过程的复杂性。另外，qRT-PCR不能测出血清中miRNA的绝对含量，只能给出相对含量。由于缺乏统一的miRNA内参，不同样本之间的结果很难做比较，也限制了其在临床上的有效应用。但获得病人血清中miRNA的含量水平对于临床医生快速、准确诊断病人的病情来说至关重要。
技术实现思路
本专利技术目的一在于克服现有技术的不足，提供一种肿瘤标志物miRNA检测探针。本专利技术的第二个目的是提供一种肿瘤标志物miRNA检测芯片。本专利技术的第三个目的是提供一种肿瘤标志物miRNA检测芯片的制备方法。本专利技术的技术方案概述如下：肿瘤标志物miRNA检测探针，包括3-7种DNA单链组成的3-7枝状DNA，其中1种DNA单链由第一部分和第二部分共计20-78个核苷酸组成，并在第二部分的游离端连接有连接分子；其余2--6种DNA单链由第一部分、第二部分和第三部分共计39-102个核苷酸组成；第三部分是19-24个核苷酸序列的黏性末端；3-7种DNA单链中第一部分和第二部分核苷酸数相等，每种DNA单链中第一部分都与相邻的DNA单链的第二部分的核苷酸序列反向互补配对；所述黏性末端能与待检测的miRNA的核苷酸序列反向互补配对。一种肿瘤标志物miRNA检测芯片，包括负载有纳米金属的基板，所述负载有纳米金属的基板连接有2-3种信号分子，所述信号分子分属于按含有化学基团分类的活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子中的不同类；2-3种信号分子中的任意1种连接抗体，其余1-2种通过连接分子连接权利要求1肿瘤标志物miRNA检测探针。所述金属为银，金或铜。所述活性羧基信号分子为5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)；羧基信号分子为对巯基苯甲酸(MBA)或2-硝基-5-巯基苯甲酸(MNBA)；氨基信号分子为对巯基苯胺(PATP)或2-氨基-6-巯基嘌呤(6-TG)。一种肿瘤标志物miRNA检测芯片的制备方法，包括如下步骤：1)制备负载有纳米金属的基板；2)制备肿瘤标志物miRNA检测探针：(1)分别合成3-7种DNA单链，其中1种DNA单链由第一部分和第二部分共计20-78个核苷酸组成；再在第二部分的游离端连接有连接分子；其余2--6种DNA单链由第一部分、第二部分和第三部分共计39-102个核苷酸组成；第三部分是19-24个核苷酸序列的黏性末端；3-7种DNA单链中第一部分和第二部分核苷酸数相等，每种DNA单链中第一部分都与相邻的DNA单链的第二部分的核苷酸序列反向互补配对；所述黏性末端能与待检测的miRNA的核苷酸序列反向互补配对；(2)将步骤(1)获得的各种DNA单链分别配成浓度为1uM-100μM的DNA单链水溶液，等摩尔量混合，加入NaCl使终浓度为50-100mM，混匀，置于PCR仪中，升温至95-90℃，在0.5-2小时内降温到25-4℃，得到肿瘤标志物miRNA检测探针；3)使用微接触印刷技术，用印章分别接触1-2种信号分子溶液，吹干，将印章与负载有纳米金属的基板接触20-30s，使印章上的信号分子与纳米金属基底表面发生化学键合，用溶剂冲洗；4)将步骤3)获得的产物浸泡于另1种信号分子溶液中，浸泡2-12h，使步骤3)获得的产物再次连接上信号分子；所述信号分子分属于按含有化学基团分类的活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子中的不同类；5)将步骤4)获得的产物的信号分子中任意1种连接抗体，其余1-2种分别与肿瘤标志物miRNA检测探针中的连接分子连接。步骤5)具体的步骤是：当信号分子是活性羧基信号分子和羧基信号分子时的步骤为：将步骤4)获得产物浸于3μM肿瘤标志物miRNA检测探针溶液中放置4h,转移到10μM的丁胺溶液中，室温下浸泡60min，封闭未反应活性羧基,转移到含10mMNHS和70mMEDC的溶液中，反应1h，活化羧基信号分子末端的羧基，用pH＝7-9的磷酸盐缓冲液清洗，转移到含质量浓度10％的抗体溶液中，放置4h，使抗体与羧基信号分子结合，转移到质量浓度0.1％BSA溶液中，放置40min，以封闭羧基信号分子未反应的羧基。所述丁胺溶液、BSA溶液、抗体溶液和肿瘤标志物miRNA检测探针溶液的溶剂为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；含10mMNHS和70mMEDC的溶液的溶剂为pH＝6.8的磷酸盐缓冲液。NHS是N-羟基琥珀酰亚胺缩写EDC是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺缩写当信号分子是氨基信号分子和羧基信号分子时的步骤为：将步骤4)获得产物浸于含10mMNHS和50mMEDC的溶液中，放置1h，活化羧基信号分子末端的羧基，转移到含0.3μM肿瘤标志物miRNA检测探针溶液中，静置4h，转移到100μM的丁胺溶液中，放置40min，以封闭羧基信号分子未反应的羧基。用pH＝8的磷酸盐缓冲液清洗，转移到到含10mMNHS，60mMEDC和质量浓度20％抗体的溶液中，放置4h，使抗体与氨基信号分子结合。所述丁胺溶液、BSA溶液、抗体溶液和肿瘤标志物miRNA检测探针溶液的溶剂为pH＝8的磷酸盐缓冲液；含10mMNHS和60mMEDC的溶液的溶剂为pH＝6.8的磷酸盐缓冲液。当信号分子是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肿瘤标志物miRNA检测探针，其特征是包括3‑7种DNA单链组成的3‑7枝状DNA，其中1种DNA单链由第一部分和第二部分共计20‑78个核苷酸组成，并在第二部分的游离端连接有连接分子；其余2‑‑6种DNA单链由第一部分、第二部分和第三部分共计39‑102个核苷酸组成；第三部分是19‑24个核苷酸序列的黏性末端；3‑7种DNA单链中第一部分和第二部分核苷酸数相等，每种DNA单链中第一部分都与相邻的DNA单链的第二部分的核苷酸序列反向互补配对；所述黏性末端能与待检测的miRNA的核苷酸序列反向互补配对。

【技术特征摘要】
1.肿瘤标志物miRNA检测探针，其特征是包括3-7种DNA单链组成的3-7枝状DNA，其中1种DNA单链由第一部分和第二部分共计20-78个核苷酸组成，并在第二部分的游离端连接有连接分子；其余2--6种DNA单链由第一部分、第二部分和第三部分共计39-102个核苷酸组成；第三部分是19-24个核苷酸序列的黏性末端；3-7种DNA单链中第一部分和第二部分核苷酸数相等，每种DNA单链中第一部分都与相邻的DNA单链的第二部分的核苷酸序列反向互补配对；所述黏性末端能与待检测的miRNA的核苷酸序列反向互补配对。2.一种肿瘤标志物miRNA检测芯片，包括负载有纳米金属的基板，所述负载有纳米金属的基板连接有2-3种信号分子，所述信号分子分属于按含有化学基团分类的活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子中的不同类；2-3种信号分子中的任意1种连接抗体，其余1-2种通过连接分子连接权利要求1肿瘤标志物miRNA检测探针。3.根据权利要求2所述的芯片，其特征是所述金属为银，金或铜。4.根据权利要求2所述的芯片，其特征是所述活性羧基信号分子为5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)；羧基信号分子为对巯基苯甲酸或2-硝基-5-巯基苯甲酸；氨基信号分子为对巯基苯胺或2-氨基-6-巯基嘌呤。5.一种肿瘤标志物miRNA检测芯片的制备方法，其特征是包括如下步骤：1)制备负载有纳米金属的基板；2)制备肿瘤标志物miRNA检测探针：(1)分别合成3-7种DNA单链，其中1种DNA单链由第一部分和第二部分共计20-78个核苷酸组成；再在第二部分的游离端连...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，仰大勇，张杰，程林秀，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12