分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于化学物质检测技术领域，利用分光瞳设计，有效屏蔽激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰，提高系统的信噪比。此外，将共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用共焦技术实现待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术实现待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。并且在样品表面的荧光信息测量过程中，本发明专利技术使用了多种不同的分立荧光探测手段，包括荧光光谱检测和荧光寿命检测。本发明专利技术在生物学，医学，材料科学以及临床医学诊断领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置
本专利技术属于化学物质检测
，不仅可以对物质的成分进行高灵敏度鉴别，还可以对物质成分的空间分布进行探测，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。
技术介绍
在生物、物理、化学和材料等学科领域，光谱检测及分析由于其具有非常高的灵敏度、分子特异性和非接触测量特性已经成为基础研究的一项基本的测量手段。其中，荧光光谱检测是利用物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。特别是对大多数有机化合物来说，其产生的荧光通常具有很强的特异性，指向性。因此荧光光谱检测尤其适合运用于对这些荧光特异性强的有机化合物的成分分析。在工业界，荧光光谱检测可用于各种污染物的成分检测、工业原料成分检测、石油原油成分检测等等。在食品安全领域，荧光光谱检测可用于对食品的霉变细菌、农药残留量等信息进行检测和监控。在医学领域，荧光光谱技术和荧光显微成像技术为肿瘤和癌症的实时成像和检测提供了新的方向，并且有望发展成为适用于临床诊断的医疗技术。由此可见，荧光光谱检测技术是一种非常实用而且有前景的光学检测手段。通常，荧光测量技术包括荧光光谱测量和荧光寿命测量两种方式。荧光光谱测量技术是通过对从待检样品发出荧光的光谱分布检测来实现的，即固定激发波长，探测样品的发射光强与入射光波长的关系曲线。荧光光谱技术经常跟荧光探针相结合，应用在DNA测序、高分子材料科学、生物荧光成像等领域。与此相对，荧光寿命检测是脉冲光源激发后从待检样品中激发出的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件直接相关，因此从样品所激发出来荧光的寿命值是绝对的，不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测量因素的制约。通过对样品进行荧光寿命测量还可对待测样品所处的微环境的很多生化参数如pH值、离子浓度、温度等分布进行定量测量。然而，在对待测样品的表面激发荧光进行扫描成像的过程中，当待测样品表面存在起伏不平时，无法保证激发光束在待测样品表面不同位置的光斑大小一致，进而导致检测系统在不同位置处分辨率无法保持一致。尤其对于一些起伏较大的样品，甚至存在由于系统测量物镜工作距离很小造成在样品扫描过程中物镜碰撞待测样品的可能性，最终不但得不到样品表面的荧光分布成像，而且导致系统物镜的表面受到污染。除此之外，在探测微弱荧光信号时，在激发光路上，强光不仅会激发样品的荧光，也会激发光学元件的自发荧光，对实验结果产生干扰，降低系统的信噪比。共聚焦显微成像技术利用针孔探测器严格对应探测系统探测光束聚焦焦点的特性，使得系统具有了及其精确的纵向表面定位的能力，可用于对待测样品表面的三维轮廓信息进行高灵敏度高空间分辨率检测。分光瞳设计，可以有效屏蔽激发光路中其他光学元件激发出来的自发荧光信号，提高系统的信噪比。因此，如果能将具有纵向表面定位能力的共焦显微成像技术和分光瞳设计运用到荧光扫描成像系统中，不仅可以保证荧光成像系统在待测样品表面每一个位置都保证相同的横向分辨率，并有效避免扫描过程中物镜碰撞表面起伏较大的待测样品，也可以有效屏蔽光学元件的自发荧光，提高系统的信噪比。在整个扫描测量过程完成以后可同时得到待测样品高分辨的物体三维形貌信息，并且测得的荧光光谱分布可以和三维形貌进行精确的对应。这将对全面精确地分析待测样品的空间成分分布具有重大的意义，可在生物学、材料学、医学等研究领域得到广泛应用。
技术实现思路
为了解决具有三维空间形状待测样品的表面荧光光谱及荧光寿命测量难题，以及激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰问题，同时得到待测样品具有高轴向分辨率的三维形貌信息及其表面各点对应的高信噪比的荧光光谱信息和荧光寿命信息，本专利技术提出了“分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置”。本专利技术的具体思路为：利用分光瞳设计，有效屏蔽激发光路中光学元件自发荧光对结果的干扰，提高系统的信噪比。此外，将共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用共焦技术实现待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术实现待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。一方面，本专利技术提供了分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，括脉冲激光光源和连续激光光源，第一分光镜、扩束镜、照明光瞳、物镜、收集光瞳、一号反射镜、一号二向色分光镜、共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；其中，在物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、照明光瞳和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，合成光束由扩束镜扩束后穿过照明光瞳，然后被物镜会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品表面激发出来的后向散射光及荧光通过所述物镜收集后，经过收集光瞳，然后由一号反射镜反射；从一号反射镜反射后的光束由一号二向色分光镜分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品进行扫描移动；信号采集器将共焦探测系统探测得到的随待测样品高度变化的光强响应信号转化后传输给计算机，由计算机处理后得到共焦响应曲线，通过共焦响应曲线的最大值位置精确确定待测样品表面各点的高度值；当探测光束聚焦在待测样品表面的各采样点位置时，信号采集器将分立荧光光谱及荧光寿命探测系统探测得到的不同波长下随时间变化的荧光光强信息通过转化后传输给计算机，由计算机处理后得到从各采样点激发出来的不同波长下的荧光寿命及荧光光谱；进而通过扫描待测样品得到待测样品表面的三维形貌以及表面各点在不同波长下的荧光寿命及荧光光谱。另一方面，本专利技术还提供了一种分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其步骤为：(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后透过经过照明光瞳、物镜，聚焦在待测样品上；定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向；(b)光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜、收集光瞳后、由一号反射镜反射；由一号反射镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；(c)打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x1,y1)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用共焦探测系统测得随扫描位置变化的共焦响应曲线I(z)，进而根据共焦响应曲线I(z)的峰值响应点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；(d)关闭连续激光光源，根据步骤(c)测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源和连续激光光源，其特征在于：包括第一分光镜、扩束镜、照明光瞳、物镜、收集光瞳、一号反射镜、一号二向色分光镜、共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；其中，在物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、照明光瞳和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，合成光束由扩束镜扩束后穿过照明光瞳，然后被物镜会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品表面激发出来的后向散射光及荧光通过所述物镜收集后，经过收集光瞳，然后由一号反射镜反射；从一号反射镜反射后的光束由一号二向色分光镜分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品进行扫描移动；信号采集器将共焦探测系统探测得到的随待测样品高度变化的光强响应信号转化后传输给计算机，由计算机处理后得到共焦响应曲线，通过共焦响应曲线的最大值位置精确确定待测样品表面各点的高度值；当探测光束聚焦在待测样品表面的各采样点位置时，信号采集器将分立荧光光谱及荧光寿命探测系统探测得到的不同波长下随时间变化的荧光光强信息通过转化后传输给计算机，由计算机处理后得到从该采样点激发出来的不同波长下的荧光寿命及荧光光谱；进而通过扫描待测样品得到待测样品表面的三维形貌以及表面各点在不同波长下的荧光寿命及荧光光谱。...

【技术特征摘要】
1.分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源和连续激光光源，其特征在于：包括第一分光镜、扩束镜、照明光瞳、物镜、收集光瞳、一号反射镜、一号二向色分光镜、共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；其中，在物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、照明光瞳和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，合成光束由扩束镜扩束后穿过照明光瞳，然后被物镜会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品表面激发出来的后向散射光及荧光通过所述物镜收集后，经过收集光瞳，然后由一号反射镜反射；从一号反射镜反射后的光束由一号二向色分光镜分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品进行扫描移动；信号采集器将共焦探测系统探测得到的随待测样品高度变化的光强响应信号转化后传输给计算机，由计算机处理后得到共焦响应曲线，通过共焦响应曲线的最大值位置精确确定待测样品表面各点的高度值；当探测光束聚焦在待测样品表面的各采样点位置时，信号采集器将分立荧光光谱及荧光寿命探测系统探测得到的不同波长下随时间变化的荧光光强信息通过转化后传输给计算机，由计算机处理后得到从该采样点激发出来的不同波长下的荧光寿命及荧光光谱；进而通过扫描待测样品得到待测样品表面的三维形貌以及表面各点在不同波长下的荧光寿命及荧光光谱。2.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述共焦探测系统包括共焦会聚透镜、共焦针孔和共焦光强传感器：共焦针孔放置于共焦会聚透镜的焦点位置处，由共焦会聚透镜将进入共焦探测系统的光束聚焦后照射在共焦针孔上，光束由共焦针孔进行空间滤波后被共焦光强传感器探测接收。3.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光强传感器探测接收，得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息；各窄带滤光片对应的中心波长为λn，带通宽度为δλn，其中，n=1,2,…,N。4.根据权利要求3所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：用多光强传感器组替代所述使用的N个光强传感器：多光强传感器组由N个光强传感器组成，用多光强传感器组中的各光强传感器分别探测得到对应的荧光强度信息。5.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光纤聚焦透镜、N个具有不同延时时间的光纤延时线以及一个光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光纤聚焦透镜耦合进入N个具有不同延时时间的光纤延时线；经过光纤延时线延时后的N路荧光在光纤延时线末端合成输出，由（N+1）号光强传感器探测接收；此时不同波长的荧光将在不同时刻到达（N+1）号光强传感器，根据不同的时段将不同波长下的荧光信息分开。6.根据权利要求1所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括一个滤光片转轮和（N+2）号光强传感器：所述滤光片转轮上由N个具有不同中心波长的窄带滤光片组成，滤光片转轮每转动一下，脉冲激光光源每发出一个脉冲激光，从待测样品激发出来的荧光光束透过对应中心波长下的窄带滤光片，（N+2）号光强传感器测得相应波长下随时间变化的荧光光强信息；滤光片转轮转动N次后可以得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息。7.根据权利要求3或6所述的分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：在所述各光强传感器前分别加上会聚透镜和针孔：针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳苗，李静伟，龚雷，
申请(专利权)人：杨佳苗，
类型：发明
国别省市：上海,31