一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物，以及还可以包括如SEQ ID No.4所示的荧光探针，该对引物所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增B族链球菌，从而将其与常见的临床病菌分离开来。基于该对引物的试剂盒和PCR检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种基因工程
，尤其涉及一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法。
技术介绍
B族链球菌学名无乳链球菌(S.agalactiac)，是一种革兰氏阳性球菌，育龄女性中15％-35％带有生殖道和消化道B族链球菌菌落，是围产期感染中重要的致病菌。B族链球菌感染可引起新生儿严重的败血症和脑膜炎，传统的诊断手段是标准细菌培养筛查，但该方法至少需要24-48小时才能得到结果，时间较长，且免疫学的敏感性与检测菌量相关，低浓度的菌量难以检出，因此临床上迫切需要一种灵敏、快速的方法在产前对B族链球菌感染进行检测。基于实时荧光PCR的高分辨率溶解曲线法全部操作过程只需2-4小时即可完成，能更好地满足临产前检测的需要。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供高特异性的用于检测B族链球菌的核苷酸序列组。本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测B族链球菌的试剂盒。本专利技术的目的之三在于提供一种用于检测B族链球菌的方法。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，包括以SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物。进一步地，还包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种用于检测B族链球菌的试剂盒，包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物和如序列表SEQIDNo.4所示的探针。进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。进一步地，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以B族链球菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。本专利技术的目的之三采用以下技术方案实现：一种用于检测B族链球菌的方法，包括以下步骤：1)获得阳性质粒的标准品：以B族链球菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；2)PCR鉴定：分别以待测样品的DNA、阳性质粒的标准品为模板，以ddH2O为阴性对照，通过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物进行PCR反应检验。进一步地，步骤2)中，PCR反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL、dNTP(2.5μM)0.5μL、上游引物(1μM)0.5μL、下游引物(1μM)0.5μL、模板0.5μL、Taq酶(5U)0.5μL和ddH2O补足25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。进一步地，步骤2)中，PCR扩增体系包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针。进一步地，PCR反应体系：2×premix10μL、上游引物(10μM)0.2μL、下游引物(10μM)0.2μL、探针(10μM)0.2μL、模板0.3μL、ddH2O补足至20μL；PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供用于检测B族链球菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法，主要是以对B族链球菌高度保守的特异性的16SrDNA基因作为耙序列，设计如SEQIDNo.2所示的上游引物和如SEQIDNo.3所示的下游引物，该序列的扩增长度为390p，其对B族链球菌具有较好的特异性，能有效地将其与临床常见的细菌特异性识别出来；本专利技术同时还提供了与如SEQIDNo.2所示的上游引物和如SEQIDNo.3所示的下游引物相对应的探针，该探针可应用于一步荧光法定量分析样品中B族链球菌，其具有较高的灵敏度和特异性；基于上述上、下游引物和探针的试剂盒和方法，具有较便捷的操作性和较高的灵敏度、特异性。附图说明图1为实施例1耙序列的Blast结果图；图2为实施例1上下引物序列的Blast结果图；图3为实施例5的标准曲线图；图4为实施例7的灵敏度试验曲线；其中，a代表质粒浓度分别为1.00×108copies/μL、b代表质粒浓度为1.00×107copies/μL、c代表质粒浓度为1.00×106copies/μL、d代表质粒浓度为1.00×105copies/μL、e代表质粒浓度为1.00×104copies/μL、f代表质粒浓度为1.00×103copies/μL、g代表质粒浓度为1.00×102copies/μL、h代表质粒浓度为1.00×101copies/μL和阴性对照。图5为实施例7的特异性试验曲线；其中，a标准扩增曲线的为B族链球菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线分别为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照；图6为实施例8的特异性试验结果图；其中，泳道1-25依次为鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、B族链球菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、DL2000的Marker、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌、阴性对照。。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。本专利技术以高度保守、特异的16SrDNA基因作为耙序列，设计PCR扩增引物和探针，再采用PCR技术扩增B族链球菌16SrDNA基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-16S，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。本专利技术提供一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，该核苷酸序组包括以SEQIDNo.1为耙序列设计的引物对：如SEQIDNo.2所示的上游引物；和如SEQIDNo.3所示的下游引物。其中，SEQIDNo.1耙序列如下所示：5’-TTTGGTGTTTACACTAGACTGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGAGTAATTAACACATGTTAGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTGTGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGTCGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，其特征在于，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，其特征在于，包括以SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物。2.如权利要求1所述的用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，其特征在于，还包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。3.如权利要求2所述的用于检测B族链球菌的核苷酸序列组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。4.一种用于检测B族链球菌的试剂盒，其特征在于，包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物和如序列表SEQIDNo.4所示的探针。5.如权利要求4所述的检测B族链球菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。6.如权利要求4所述的检测B族链球菌的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以B族链球菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。7.一种用于检测B族链球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得阳性质粒的标准品：以B族链球菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，李琳，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32