一种利用RNA干扰机制的分子传感器制造技术

本发明专利技术提供了一种利用RNA干扰机制的分子传感器，所述分子传感器包括以下几个部分：1.核酸酶缺陷型CRISPR‑Cas9蛋白；2.前体合成引导RNA(pre‑sgRNA)，所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；3.报告基因；所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用RNA干扰机制的分子传感器
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言涉及一种利用RNA干扰机制的分子传感器。
技术介绍
RNA干扰机制RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由单链或双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi具有如下特征：1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制；2)RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；5)dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；6)ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。小干扰RNA(SiRNA)病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA(小干扰RNA，smallinterferingRNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。siRNA通常作为RNAi的工具被人工合成，但是后来发现很多生物包括线虫还有人类一些特殊的细胞也会合成内源性siRNA，以用于基因表达的调控。微小RNA(miRNA)微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为20-25个核苷酸的非编码小RNA，可以在转录后水平调控基因表达。miRBase数据库最新预测结果显示，人类基因组可能表达2656种miRNA，这些miRNA广泛分布在人体各种组织和器官中。大部分组织和器官都具有专一的miRNA表达谱。掌握各种miRNA在不同组织中的表达谱，对于理解相关组织的发育和疾病形成至关重要。2016年NicoleLudiwig和他的同事利用芯片技术检测了1997种miRNA在两具男性尸体61种组织样本中的表达量。最后他们只检测到1364种miRNA至少在其中一种组织中表达，有143种miRNA在每种组织中都表达。他们利用组织特异指数TSI(tissuespecificityindex)来定义miRNA的分布情况。当某个miRNA在每种组织中都表达，那么TSI定义为0，如果这个miRNA只在一种组织中特异表达，那么它的TSI则为1。大部分(82.9％)的miRNATSI在分布0.5到0.85之间，表明miRNA具有很高的组织特异性。某些miRNA在特定组织中表达量极高。例如，miR-122在成体每个肝脏细胞中的表达量高达66000个分子，是组织中表达量最高的miRNA。miR-7和miR-375以及miR-141和miR-200a在脑下垂体中特异表达，miR-142，miR-144，miR-150，miR-155和miR-223在造血细胞中特异表达。miR-144在血管和脾脏中表达量最高，在甲状腺中也有较高表达的量，而在甲状腺乳头癌中降低。另外miR-1-3p，miR-133a-3p，miR-133b在心肌和肌肉中特异表达。这些miRNA在肌肉发育中调控关键的基因。miR-338-3p，miR-219-5p，miR-124-3p和miR-9-5p在脑组织中特异表达。miR-507，miR-514a-3p和miR-509-5p只在睾丸中表达。而miR-205-5p只在皮肤中表达，其表达量在生黑色素细胞中最高，随着黑色素瘤的形成下降。另外，鉴定组织特异表达的miRNA可以作为某种疾病在血液中的生物标记物。例如药物导致的肝脏损伤，脂肪肝，乙肝和丙肝的感染以及肝癌都会导致血清中肝脏特异的miR-122表达量的上升。血清中miR-1，miR-206和miR-133a/b的上升，可以作为心脏衰竭以及不同肌肉萎缩症状的生物标记物。另外跑完半程马拉松也会导致血液中这些miRNA上升。各种miRNA对基因表达的影响主要在转录后水平。miRNA与其靶mRNA之间的部分互补导致靶mRNA的去稳定化和/或翻译抑制，而miRNA与其靶mRNA之间的完全或接近完全互补导致靶mRNA在特定位置处的切割。许多miRNA只在特定组织，细胞类型和发育或疾病阶段表达。因此，miRNA谱已被成功用于表征人类肿瘤的发育谱系和分化状态，并且在很多情况下，miRNA谱比mRNA谱更准确和翔实。另外，在疾病的分化或进展过程中，miRNA表达常常动态改变。综上所述，siRNA和miRNA表达活性的检测对于跟踪干细胞的分化状态和疾病进展具有重大意义。然而，由于siRNA和miRNA对基因表达的抑制性质，可被siRNA或miRNA激活从而表征siRNA或miRNA活性的报告物目前仍然是生物
中的空白。
技术实现思路
本专利技术人利用miRNA介导的sgRNA释放策略创建了本专利技术的MICR-ON平台系统，该平台系统可以被特定的内源或外源miRNA/siRNA打开从而激活报告基因的表达，从而使得表征细胞内表征siRNA或miRNA的活性。据此，本专利技术提供了一种利用RNA干扰机制的分子传感器，所述分子传感器包括以下几个部分：1.核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白；2.前体合成引导RNA(pre-sgRNA)，所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；3.报告基因；所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子相连接。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用RNA干扰机制的分子传感器，所述分子传感器包括以下几个部分：(1)核酸酶缺陷型CRISPR‑Cas9蛋白；(2)前体合成引导RNA，所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；(3)报告基因；所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。

【技术特征摘要】
1.一种利用RNA干扰机制的分子传感器，所述分子传感器包括以下几个部分：(1)核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白；(2)前体合成引导RNA，所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；(3)报告基因；所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。2.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制的分子传感器，其中所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子相连接。3.根据权利要求2所述的利用RNA干扰机制的分子传感器，其中所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一种或多种。4.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器，其中所述前体合成引导RNA仅在合成引导RNA序列的一端含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列，或者其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端均含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。5.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器，其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是相同或不同的序列。6.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器，...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳明，王茜雯，胡鲁峰，廖乐祺，邱雅姿，石铭，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11