一种具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质及其制备方法技术

技术编号:19502976 阅读:48 留言:0更新日期:2018-11-21 03:13
本发明专利技术属于生物技术中荧光蛋白质领域,具体的说是涉及一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT,藻蓝蛋白β亚基基因cpcB,血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌,构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径,制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。本发明专利技术是利用生物技术方法在大肠杆菌体内生产荧光蛋白质,是一种环境友好、成本低的制备方法。该荧光蛋白质可用于荧光检测等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质及其制备方法
本专利技术属于生物技术中荧光蛋白质领域,具体的说是涉及一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。
技术介绍
藻胆蛋白是藻类重要的色素蛋白,具有光能捕获和传递的作用。每分子的藻胆蛋白含有两条结构相似的多肽链α和β,α亚基和β亚基分别含有约160~180个氨基酸残基,二者的比例通常为1:1。亚基中的半胱氨酸残基通过硫醚键与藻胆色素共价结合,藻胆色素的种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定了藻胆蛋白的光谱学性质。根据吸收光谱的不同,可将藻胆蛋白分为4大类:即藻红蛋白PE,λmax=540nm~570nm,藻红蓝蛋白PEC,λmax=567nm,藻蓝蛋白PC,λmax=615nm~640nm和别藻蓝蛋白APC,λmax=650nm~655nm。藻胆蛋白具有强烈的荧光特性,已广泛应用于流式细胞分析和免疫荧光检测等领域。近年来,随着藻胆蛋白生物合成途径的阐明,以及合成生物学技术的发展,在大肠杆菌中人工构建完整藻胆蛋白(含蛋白亚基和色基)的生物合成途径。通过工程菌规模化发酵,实现藻胆蛋白在大肠杆菌中的生物合成与组装,然后通过亲和层析纯化制备重组藻胆蛋白。Tooley等人在国际上率先实现了藻蓝蛋白α亚基(2001年)和藻红蓝蛋白α亚基(2002年)在大肠杆菌中藻胆蛋白的组合生物表达,为藻胆蛋白的制备提供了一条全新的途径。在国内,本专利专利技术人在藻胆蛋白的组合生物表达,藻胆蛋白的分子进化以及新型人工藻胆蛋白荧光探针分子设计和构建方面,展开了系统性的研究工作,已实现多种藻胆蛋白亚基与多聚体在大肠杆菌中的生物合成与组装,通过蛋白分离纯化技术获得的重组藻胆蛋白,具有与天然藻胆蛋白相似的光谱学性质。此外,通过链霉亲和素和藻胆蛋白的融合表达,获得了同时具有生物素结合能力和荧光特性的融合藻胆蛋白荧光探针分子。通过基因工程方法获得重组藻胆蛋白,具有快速高效、成本较低、不受季节气候影响等突出优势。但是,目前重组合成的藻胆蛋白荧光蛋白质普遍存在的问题是重组藻胆蛋白只结合一个藻胆色素分子,其斯托克斯位移较小,通常为10-25nm。由于激发光波长和荧光检测波长接近,激发光容易对荧光检测造成干扰。而较大的斯托克斯位移,不仅可以增加荧光检测的信噪比,而且可以降低荧光蛋白质分子的自猝灭作用。本专利技术提供一种具有大斯托克斯位移的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案为:一种大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法:利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT,藻蓝蛋白β亚基基因cpcB,血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌,构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径,制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。具体为:1)利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS插入第一个表达载体中,将藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和藻胆蛋白裂合酶cpcT组成多顺反子插入第二个表达载体的一个表达框中,将血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS组成多顺反子插入到第二个表达载体的另一个表达框中;2)将上述两个载体共转化到大肠杆菌中,而后发酵合成获得结合藻尿胆素和藻红胆素的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质,通过亲和层析的方法,纯化得到相应的重组荧光蛋白质。所述第一个表达载体含有阿拉伯糖诱导启动子;第二个表达载体含有乳糖诱导启动子。所述第一个表达载体为pBad-HisA,pBad-HisB或pBad-HisC;第二个表达载体为pRSFDuet-1,pCDFDuet-1或pACYCDuet-1。一种制备获得大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质,按所述的方法制备获得共价结合一个藻红胆素分子和一个藻尿胆素分子的斯托克斯位移达68.5nm的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质。与现有技术相比,本专利技术具有以下优点:1.利用两种基于不同诱导物的表达载体,构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径,通过不同诱导时机分别添加不同诱导物,与传统表达载体构建策略相比,可以调控外源基因的表达顺序,从而实现重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质的生物合成;2.现有重组藻胆蛋白荧光蛋白质只结合一个藻胆色素分子,其斯托克斯位移为10-25nm,本专利技术制备的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质,同时共价结合藻尿胆素和藻红胆素分子,通过藻尿胆素和藻红胆素分子间的荧光能量共振转移,使斯托克斯位移达到68.5nm,有利于提高荧光检测的信噪比;3.增加藻胆蛋白斯托克斯位移的常用策略是将其与其他荧光物质偶联,偶联过程复杂,成本较高。本专利技术中,通过重组大肠杆菌发酵制备,大肠杆菌生长快,生长周期短,易于破碎,由于重组蛋白携带HIS标签,利用亲和层析可获得高纯度的重组蛋白,纯化过程简单,制备成本较低。附图说明图1是本专利技术实施例的经过纯化后的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收光谱图。图2是本专利技术实施例的经过纯化后藻蓝蛋白类荧光蛋白质样品,经过酸性尿素变性后测定的吸收光谱图。图3是本专利技术实施例的经过纯化后藻蓝蛋白类荧光蛋白质的荧光发射光谱图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术的具体实施方式进行阐述,所述的实施方式仅仅用来解释和说明本专利技术,其并不限制本专利技术的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术能够想到的等价的变体都包含在本专利技术的保护范围中。本制备方法是将藻蓝蛋白β亚基(cpcB)基因、藻胆蛋白裂合酶基因(cpcS和cpcT)和藻红色素生物合成酶基因(Ho1和pebS)分别克隆到两种不同大肠杆菌表达载体。表达载体共转化大肠杆菌后,通过不同诱导时机分别添加乳糖和阿拉伯糖,诱导外源基因的表达,获得同时共价结合藻尿胆素和藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。通过两个藻胆色素分子间的荧光能量共振转移,获得具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。本专利技术是利用生物技术方法在大肠杆菌体内生产荧光蛋白质,是一种环境友好、成本低的制备方法。该荧光蛋白质可用于荧光检测等领域。实施例11.基因的克隆从美国国立生物信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获取Anabaenasp.PCC7120cpcB,SynechococcuselongatusBP-1Ho1,ProchlorococcusphageP-SSM2pebS(AccessNo.Q58MU6),SynechococcuselongatusBP-1cpcS和Anabaenasp.PCC7120cpcT基因序列。据此分别设计扩增cpcB,Ho1,pebS,cpcS和cpcT基因的特异引物(表1)。cpcB基因以Anabaenasp.PCC7120基因组DNA为模板,利用表1中记载的特异性引物,用过PCR扩增获得;Ho1以Synechocytissp.PCC6803基因组DNA为模板,利用表1中记载的特异性引物,用过PCR扩增获得;cpcS以SynechococcuselongatusBP-1基因组DNA为模板,利用表1中记载的特异性引物,用过PCR扩增获得;cpcT以Anabaenasp.PCC7120基因组DNA为模板,利用表1中记载的特异本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法,其特征在于:利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT,藻蓝蛋白β亚基基因cpcB,血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌,构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径,制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法,其特征在于:利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT,藻蓝蛋白β亚基基因cpcB,血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌,构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径,制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。2.按权利要求1所述的大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法,其特征在于:1)利用基因工程方法,将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS插入第一个表达载体中,将藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和藻胆蛋白裂合酶cpcT组成多顺反子插入第二个表达载体的一个表达框中,将血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS组成多顺反子插入到第二个表达载体的另一个表达框中;2)将上述两个载体共转化到大肠杆菌中,而后发酵合成获得结合藻尿胆素...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈华新姜鹏
申请(专利权)人:中国科学院海洋研究所
类型:发明
国别省市:山东,37

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