一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用。本发明专利技术克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并以野生型番茄与超表达SlbZIP6番茄为对象，在高温胁迫下，对番茄的抗逆性表型、脯氨酸含量、丙二醛含量、相对电导率情况以及参与耐热调控的分子机制等进行研究，结果证实SlbZIP6参与了番茄的耐热性调控机制，且超表达SlbZIP6番茄耐热性比野生型更差。检测该基因表达水平，用于番茄耐热育种筛选。本发明专利技术可为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。

【技术实现步骤摘要】
一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用。
技术介绍
高温胁迫是近几年植物遭受的最主要的胁迫因素之一，每年在全球范围内频繁发生，严重的制约了农作物的产量和品质。因此，培育耐高温品种是现代作物育种亟待解决的问题之一。目前，已有很多研究报道了高温对蔬菜作物的不良影响，但是现在高温对番茄影响的报道大多是针对番茄经济性状指标等方面，而有关高温胁迫对番茄的影响及其分子机制的报道还比较少，其分子机制还不清楚有待深入研究。转录因子是一类通过识别并结合在目标基因上游的启动子区域来调控靶基因的转录表达的蛋白，常常参与植物的生长发育、抗盐、抗干旱、抗病等调控途径。碱性亮氨酸拉链(basicleucinezipper,bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类转录因子，普遍存在于植物、动物及微生物中。已经有研究证实，植物生长、衰老、损伤、花发育、种子成熟等生理生化过程都有bZIP类转录因子的参与，它与植物抵御多种逆境胁迫密切相关，在植物生命活动中起着重要的作用。最近，Liu等研究发现，过量表达水稻OsbZIP71能够增强水稻的耐盐性和抗旱性(C.Liuetal.2014)。Xu研究表明，和野生型相比，转GmbZIP110基因植株有更强的耐盐能力(Z.Xuetal.2016)。但有关番茄相关基因的研究特别是有关高温胁迫的基因鲜有报道。因此本专利技术克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并研究了番茄SlbZIP6在高温胁迫下的作用及作用机制。本专利技术在培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义，为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其参与非生物胁迫反应，参与番茄的耐热性调控。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。作为优选的方案，基因SlbZIP6的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。通过前期的基因芯片筛选及生物信息学分析，发现了一个番茄bZIP转录因子SlbZIP6参与非生物胁迫反应。本研究在AC++番茄中克隆得到SlbZIP6基因，长度为1365bp，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。生物信息学表明SlbZIP6转录因子编码454个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，分子量48.61kD。SlbZIP6蛋白不具信号肽序列，不具有跨膜结构域，定位于细胞核中。本专利技术的目的之二在于提供一种目的一基因的克隆方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：目的一的基因的克隆方法包括以下步骤：1)番茄叶片cDNA的提取；2)以步骤1)提取的cDNA为模板，根据目的一的SlbZIP6基因序列设计引物，进行PCR扩增；3)回收PCR产物，并测序。作为优选的方案，上述引物的序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术的目的之三在于提供一种目的一的SlbZIP6基因在番茄抗高温胁迫中的应用，其对于培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：目的一的番茄转录因子基因SlbZIP6在番茄抗高温育种中的应用，具体为，筛选低表达SlbZIP6的番茄植株，获得更耐高温的番茄的种子。本专利技术首先获得超表达SlbZIP6基因的番茄植株和抑制表达SlbZIP6基因的转基因番茄植株。对超表达SlbZIP6基因的番茄植株和野生型AC++番茄植株进行42℃高温处理3天。结果野生型AC++和转基因株系之间的表型有明显的表型差异，野生型AC++在经过高温处理3d后，只有其下部的叶片开始萎蔫失水，植株顶部的叶片生长较正常，叶片依然挺立；然而，超表达SlbZIP6基因的株系，在高温处理3d后，整个植株叶片都萎蔫失水，植株呈现倒伏的状态不再挺立。从个体水平上说明超表达SlbZIP6增加了番茄植株对高温的敏感性。对SlbZIP6基因参与番茄耐热验证以及参与机制研究主要在电导率、MDA、渗透调节和分子机制等几个方面，验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性，具体结果为：过量表达SlbZIP6增加了高温胁迫下转基因番茄植株的相对电导率和丙二醛的积累以及减少了脯氨酸的积累，以上三种都将导致在高温胁迫下番茄植株受到更大伤害，从细胞水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。也探索了SlbZIP6调控番茄高温耐受能力的分子机制，从分子水平上验证了SlbZIP6基因减弱了番茄植株对高温的耐性。综上，本专利技术为通过番茄育种提高番茄的抗热性开辟一条新途径。本专利技术的目的之四在于提供一种抗高温番茄的种子，其通过筛选低表达目的一的SlbZIP6基因的番茄植株获得。以达到增加番茄植株对高温的抵抗能力，减轻高温可能对植株造成的伤害的目的。本专利技术的目的之五在于提供一种包含目的一的基因的重组载体。本专利技术的SlbZIP6基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种抑制转录启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。含有本专利技术所述SlbZIP6基因的重组载体均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的目的之六在于提供一种包含目的一所述SlbZIP6基因的重组菌。作为优选的方案，上述重组菌为大肠杆菌或农杆菌。本专利技术的目的之七在于提供一种包含目的一所述SlbZIP6基因的转基因细胞系。含有本专利技术所述SlbZIP6基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌等基因工程产品均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果在于：本专利技术克隆了番茄转录因子SlbZIP6，并研究了番茄SlbZIP6在高温胁迫下的作用及作用机制。本专利技术在培育抗热性番茄新品种方面具有实践指导意义，为培育番茄抗热新品种提供分子基础，为通过基因工程手段提高番茄的抗热性开辟一条新途径，同时也为其它农作物的抗高温分子育种和品种改良提供基因资源。附图说明图1为SlbZIP6基因的克隆检测。图2为超表达载体大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNAMarker；泳道1-7：PCR扩增产物；—：阴性对照。图3为pHANNIBAL-SlbZIP6大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNAMarker；泳道1-10的引物为P7248-F和P7324R。图4为RNAi载体大肠杆菌单克隆PCR检测。其中，M:BM2000+DNAMarker；泳道1-7的引物为P7416-F和M13F-R，扩增片段大小约为2000bp；泳道8-14的引物为247B-F和P7417-R，扩增片段大小约为1500bp。图5为番茄转化的过程图。其中，A：共培养；B：愈伤组织；C：生根苗；D：移栽苗。图6为超表达植株和野生番茄经高温处理后的表型。图7为高温胁迫下转基因植株相对电导率的变化。图8为高温胁迫下转基因植株MDA含量变化。图9为高温胁迫下转基因植株Pro(脯氨酸)含量变化。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其特征在于，所述番茄转录因子基因SlbZIP6编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种番茄转录因子基因SlbZIP6，其特征在于，所述番茄转录因子基因SlbZIP6编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的基因SlbZIP6，其特征在于，所述基因SlbZIP6的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述番茄转录因子基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1)番茄叶片cDNA的提取；2)以步骤1)提取的cDNA为模板，根据权利要求1或2所述SlbZIP6基因序列设计引物，进行PCR扩增；3)回收步骤2)的PCR产物，并测序。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘宇，段玲，潘阳露，田平，苏承刚，李金华，张兴国，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50