人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体制造技术

本发明专利技术提供一种人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体，新设计的NGAL基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过密码子优化人工合成NGAL成熟肽段的基因以提高原核表达量，并利用其纯化蛋白制备出多克隆抗体及单克隆抗体，为NGAL的进一步研究奠定有力的实验基础。

【技术实现步骤摘要】
人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体。
技术介绍
人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是一种从人中性粒细胞β颗粒发现的分泌型糖蛋白，属于lipocalin蛋白家族。NGALcDNA的翻译产物为197个氨基酸残基肽链，其中前19个氨基酸是前导序列(leadersequence)，余下178个氨基酸为成熟肽段(maturepeptide)，二者构成相对分子质量为25kDa的蛋白质，具有脂质运载蛋白家族典型的桶装结构，可以结合和运输多种小分子物质，从而发挥重要的生物功能。2003年，Mishra等首次提出了NGAL与缺血型肾损伤密切相关。此后，更多的相关研究表明血液和尿液中NGAL可以作为判断急性肾损伤的早期诊断指标。近年来，国内外学者还发现它参与了其他多种疾病的发生发展，可作为肾脏疾病、肿瘤、炎症等多种疾病的一个新型敏感的生物学标志物。目前的抗原制备采用常规密码子编码，抗原表达效率比较低。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体，用于解决现有技术中NGAL抗原表达率低等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术第二方面提供含有上述序列的重组载体。在本专利技术的一些实施例中，所述重组载体选自pW28质粒。本专利技术第三方面提供含有上述重组载体的重组菌。在本专利技术的一些实施例中，所述重组菌为重组大肠杆菌。本专利技术第四方面提供由上述核苷酸序列表达的重组蛋白。本专利技术第五方面提供一种抗NGAL多克隆抗体，由上述重组蛋白作为抗原免疫动物后，分离纯化得到。在本专利技术的一些实施例中，所述动物为兔。本专利技术第六方面提供一种抗NGAL单克隆抗体，由上述重组蛋白作为抗原免疫动物后，将动物细胞与SP2/0细胞融合，将融合后的细胞进行培养，得到所述抗NGAL单克隆抗体。在本专利技术的一些实施例中，所述被免疫动物为小鼠，免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。本专利技术第七方面提供上述核苷酸序列、重组载体、重组菌、重组蛋白在制备抗NGAL抗体中的应用。如上所述，本专利技术的一种人缺血型肾损伤临床检测用NGAL的活性抗原和高亲和力抗体，具有以下有益效果：本专利技术通过人工合成经密码子优化的NGAL基因，构建原核表达重组质粒pW28-NGAL，IPTG诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态；获得的rhNGAL抗原免疫兔子制备多克隆抗体，免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型；ProteinG亲合柱纯化，等温滴定量热法及非竞争ELISA法检测抗体的亲和力，SDS-PAGE分析纯度；最后运用Westernblot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果显示，高效获得高纯度NGAL重组蛋白，主要以单体形式存在；成功制备兔多抗，同时筛选获得6株高效价单克隆抗体；其中，25号单抗为IgG1亚型，余者均属IgG2a亚型，且19、35号单抗的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109。SDS-PAGE分析表明纯度均大于90％。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性，且单抗的特异性明显高于多抗。附图说明图1显示为本专利技术实施例中密码子优化后设计的NGAL基因序列图。图2显示为本专利技术实施例中pW28-NGAL重组质粒双酶切鉴定结果图。图3显示为本专利技术实施例中NGAL纯化结果图。图4显示为本专利技术实施例中凝胶层析检测NGAL在溶液中的聚集形式图。图5显示为本专利技术实施例中抗NGAL抗体纯化结果图。图6显示为本专利技术实施例中抗NGAL抗体免疫荧光结果图(荧光显微镜×400)。图7显示为本专利技术实施例中单克隆抗体的免疫组化染色图(×400)。图8显示为本专利技术实施例中NGAL抗体特异性鉴定图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。实施例11材料及方法1.1材料1.11质粒、菌株、细胞和实验动物E.coliDH5α和E.coliB834由本实验室(感染性疾病分子生物学教育部重点实验室)保存，载体质粒pW28由pET-28a(购自Novagen公司)改造而来，人胚胎肾细胞293由本实验室保存。2只新西兰雄兔、4只SPFBALB/c雌性小鼠、5只SPF雄性裸鼠购自重庆医科大学动物中心。1.12实验试剂及仪器DL2000DNAMarker、蛋白质Marker、各种限制性内切酶(BamHⅠ和XhoⅠ)、质粒抽提试剂盒、T4DNA连接酶及Buffer购自Promega公司，BCA试剂盒购自碧云天公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗、BSA、购自Bio-world公司。荧光标记的羊抗鼠IgG二抗及DAPI染剂购自武汉三鹰公司。IMDM完全培养基(含15％血清)、HAT、HT、2.2％甲基纤维素均购自Sigma公司。抗体亚型鉴定试剂盒购自SouthernBiotech。ChemiDocTMTouch化学发光成像仪、蛋白质电泳及湿转装置购自Bio-Rad公司，EPS-300核酸电泳仪购自Eppendorf公司，PCR仪、NANOD1000微量分光光度计购自Thermo公司，多功能微孔板检测仪购自BioTek公司，超声波处理系统购SONICS公司，蛋白质超滤系统购自Micon公司。Ni2+-NTA亲和层析柱、HiloadSuperdex75凝胶层析柱、ProteinG亲和层析柱及填料购自GEHealthcare公司。等温滴定量热仪购自Malvern公司。1.2方法1.21pW28-NGAL重组质粒的构建根据GenBank(NM004012)得到人NGAL成熟肽段cDNA序列，利用OptimumGeneTM软件分析其稀有密码子并采用大肠杆菌(E.coli)偏爱密码子优化人工合成基因序列，并分别在其5'和3'末端引入BamHⅠ和XholⅠ限制性酶切位点，密码子优化后设计的NGAL基因序列如图1所示，图1中下划线部分为酶切位点，阴影部分为改变的碱基序列。合成的NGAL序列与cDNA相比，部分碱基不同但编码的氨基酸序列相同，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组载体。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体选自pW28质粒。4.含有权利要求2或3所述重组载体的重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌选自重组大肠杆菌。6.由权利要求1所述核苷酸序列表达的重组蛋白。7.一种抗NGAL多克隆抗体，由权利要求6所述重组蛋白作为抗原免疫动物后，分离纯化得到。8.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪德强，王石磊，靳鑫，魏杰，丁世家，汤华，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50