产蛋白酶的枯草芽孢杆菌及使用方法技术

本发明专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌DB005(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15646，保藏日期为2018年4月26日。本发明专利技术还公开了所述的枯草芽孢杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖，包括两种方法：（1）采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；（2）将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。所述菌株一方面能向细胞外分泌蛋白酶，所述蛋白酶可以分解饲料和环境中的蛋白质，一方面增加了刺参的生长速度，另一方面净化了水质，减少发病率，提成活率。

【技术实现步骤摘要】
产蛋白酶的枯草芽孢杆菌及使用方法
本专利技术属于生物学领域，涉及一株枯草芽孢杆菌，具体涉及一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌及使用方法。
技术介绍
随着水产养殖业的飞速发展，高密度的集约化养殖规模日益扩大，水产养殖的环境恶化和疾病的危害对水产养殖业的经济损失也愈加明显。而传统的解决办法是采用抗生素。众所周知，抗生素的使用容易产生耐药性菌株的问题，并且会在体内残留。益生菌是一定浓度范围内可以对动物体产生有益作用的活的微生物。益生菌通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，起到了促进动物生长的作用。因此，近些年来，作为抗生素的部分领域的替代品，益生菌得到迅速的发展。目前益生菌已经广泛应用于鱼类、贝类、虾类以及刺参的养殖中。Bagheri等(2008)将不同浓度的复合芽孢杆菌制剂添加到虹鳟饲料中进行两个月的投喂，结果发现高浓度的复合益生菌制剂可以明显促进虹鳟生长。Doeschate等(2008)研究证明南非鲍分离得到的土著益生菌群可以提高其消化酶活力，促进生长。Iehata等(2009)发现乳酸菌对鲍鱼肠道消化酶活性提高有一定的作用。专利技术专利申请201510896838.8提供了“一株地衣芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂”。该专利技术专利申请具体提供了一株新型地衣芽孢杆菌DN29(BacilluslicheniformisDN29)，其保藏编号为CCTCCNO：M2015482。所述的地衣芽孢杆菌DN29，能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。所述地衣芽孢杆菌DN29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。
技术实现思路
本专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，所述菌株一方面能向细胞外分泌蛋白酶，所述蛋白酶可以分解饲料和环境中的蛋白质，一方面增加了刺参的生长速度，另一方面净化了水质，减少发病率，提成活率。本专利技术的技术方案：一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌DB005(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15646，保藏日期为2018年4月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述枯草芽孢杆菌DB00516SrDNA序列如SEQNO.1所示。所述的枯草芽孢杆菌的活化方法，将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，在25-30℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L。所述的枯草芽孢杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖。所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：(1)采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；(2)将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。其中，所述方法(1)具体为：(A)将所述枯草芽孢杆菌菌株活化(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，然后取适量，投入到初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参养殖饲料；所述枯草芽孢杆菌菌液的重量分数为2-5％。(B)向混合刺参养殖饲料中加入适量水，所述水的量为初始刺参养殖饲料重量的1.5-3倍，然后在20-32℃的温度条件下发酵12-32小时，得到最终产物，即发酵刺参饲料。发酵后得到的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。用该菌株发酵刺参饲料，能使饲料中的蛋白质分解为肽类和和游离氨基酸，更加有利于刺参的消化吸收。其中，所述方法(2)具体为：将活化好的菌液，均匀投放在刺参养殖池或刺参保苗池中，使菌液的浓度为5-10PPM；并根据消耗量定期补充以维持该浓度。具体步骤为：将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)稀释10倍，然后再均匀投放到刺参保苗池或刺参养殖池中。使用浓度为5-10PPM，5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，可明显降解水体中残饵和粪便中的蛋白质，净化水质，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。一种包括所述的枯草芽孢杆菌的发酵刺参饲料，通过上述方法(1)制备得到。所述发酵刺参饲料的使用方法，其特征在于：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4-1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中；所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的1-3％。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术中的枯草芽孢杆菌DB005分泌的蛋白酶可以分解饲料的蛋白质，提高饲料的利用率，使刺参的生长速度提高，2个月的增重率由平均236.7％增加到298.3％，增加了61.6个百分点；(2)采用本专利技术所述的菌株发酵的刺参饲料养殖刺参，同时还可以分解养殖水中的残饵和粪便，净化水质，减少发病率，使用2个月后，成活率由原来的平均84.7％提高到平均90.7％，提高了5.97个百分点。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1：菌株的分离与筛选1.1有益菌的分离(1)初筛：在超净工作台中，用二蒸水适当稀释刺参池塘底泥上清液，均匀涂布于2216E固体培养基上，放于恒温培养箱中30℃恒温正置培养1小时，再倒置培养至长出单菌落。同样在超净工作台中无菌操作，用无菌牙签挑取单菌落，放于装有1mlLB液体培养基的1.5mlEP管里，使单菌落浸于培养液里后弃去牙签，盖紧盖子编号。在30℃，180rpm摇床内培养至菌液浑浊。然后与50％甘油1:1混匀，放入-80℃冰箱保存备用。(2)复筛：菌种活化：从-80℃保存的菌液取出后放在冰上解冻。在超净工作台中无菌操作，取1.5ml离心管，加入800μlLB液体培养基，200μl菌液，混匀。30℃，180rpm，摇床培养至液体浑浊。用二蒸水适当稀释活化的各个菌液，吸取适量菌液均匀涂布于酪蛋白固体培养基上，放于恒温培养箱中30℃恒温正置培养1小时，再倒置培养至长出产生蛋白水解圈的单菌落。用无菌牙签挑取可产生蛋白水解圈的单菌落，并将牙签放于装有1mlLB液体培养基的1.5mlEP管里，使单菌落落于培养液里后弃去牙签，盖紧盖子重新编号。30℃，180rpm，摇床培养至菌液浑浊。与50％甘油1:1混匀，-80℃冰箱保存备用。实施例2：菌株的鉴定取出-80℃保存的菌液，放在冰上解冻。在超净工作台中无菌操作，取1.5ml离心管，加入800μlLB液体培养基，200μl菌液，混匀。在摇床中30℃、180rpm培养至液体浑浊。然后取大约200μl菌液至于1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，弃去上清，再加入30μlDEPC灭菌水，煮沸10min，迅速放入冰中冷却5min。4℃，12000rpm，离心5min，上清为菌液PCR模板，以27F和1492R引物进行PCR扩增。PCR反应体系(10μl)：cDNA1μl、10×Buffer1μl、2.5mMdNTP0.8μl、10μM正反引物各0.5μl，0.05μlrT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌DB005 (Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.15646，保藏日期为2018年4月26日。

【技术特征摘要】
1.一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌DB005(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15646，保藏日期为2018年4月26日。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌DB00516SrDNA序列如SEQNO.1所示。3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的活化方法，其特征在于：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，接种到培养基中，在25-30℃的温度条件下培养8-10小时。4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖。5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：（1）采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；（2）将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述方法（1）具体为：(A)将所述枯草芽孢杆菌菌株活化，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯政夫，朱伟，胡彦江，赵兰廷，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37