一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途技术

本发明专利技术公开一种具有免疫原性的多肽及其制备方法，以及能够表达所述多肽的基因工程载体和基因工程细胞。本发明专利技术还公开了针对该多肽的特异性抗体的制备方法，所述抗体能够用于检测无乳链球菌，且具有较高的灵敏性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途
本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种具有免疫原性的多肽，还涉及该免疫原性多肽的抗体的制备方法和用途，更具体地，涉及所述抗体在制备用于检测无乳链球菌的试剂盒中的用途。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactea)属于B群链球菌，是重要的乳源性人畜共患的致病菌。在动物主要引起奶牛乳腺炎，在内蒙古地区约70％以上牛乳腺炎是由该致病菌引起。无乳链球菌具有多种致病因子，特别是细胞黏附及感染密切相关的菌毛样结构，可以有效的帮助无乳链球菌在宿主细胞上黏附、定植，其菌毛岛屿PI-2a编码的亚基蛋白基因簇中有3个有效保守性抗原组分，分别为菌毛骨架蛋白BP、辅助蛋白AP1和AP2。小鼠实验研究表明，无乳链球菌菌毛岛屿亚结构蛋白具有良好免疫保护性。前期研究通过生物信息学筛选、确定牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白AP1、AP2及BP的主要抗原域，利用基因工程技术串联表达3亚基基因的多表位融合蛋白，并对3个亚基融合表达蛋白进行抗原性研究，为研究牛乳腺炎无乳链球菌致病机制、新型免疫疫苗及检测试剂提供实验依据。但是，串联表达3亚基基因的多表位融合蛋白的纯化水平不高，难以达到进一步研究或应用的需要。
技术实现思路
为了解决上述技术问题的至少一种，本专利技术的第一方面提供一种多肽，其包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:8的氨基酸序列组成。本专利技术的第二方面提供一种基因，其包括SEQIDNO:7所示的核苷酸序列或由SEQIDNO:7所示的核苷酸序列组成。本专利技术的第三方面提供一种基因工程载体，其包括本专利技术第一方面所述的基因。本专利技术的第四方面提供一种基因工程细胞，其包括本专利技术第三方面所述的基因工程载体。本专利技术的第五方面提供一种本专利技术第三方面所述的基因工程载体的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得无乳链球菌核酸样本；(2)利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:6所示引物对步骤(1)获得的样本进行扩增；(3)步骤(2)扩增产品经回收纯化后连接到线性化的基因工程载体上。进一步地，包括将所述基因工程载体转化进原核表达细胞中并诱导所述基因工程载体表达的步骤。更进一步，包括对多肽进行纯化的步骤：(1)将细胞经超声破碎，离心去除细胞碎片；(2)在步骤(1)的上清液中加入硫酸铵溶液；(3)将溶液放在磁力搅拌器上搅拌，使重组蛋白充分沉淀；(4)离心收集沉淀，利用悬浮液进行悬浮。在本专利技术的实施方案中，所述硫酸铵溶液的浓底为10％～60％，例如为10、20、30、40、50、60％，再例如为15、25、35、45、55％，优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为20％；所述悬浮液为PBS缓冲液或Tris-Cl缓冲液，任选地，所述Tris-Cl缓冲液的pH值为8.5，任选地，所述PBS缓冲液含有咪唑，优选地，所述PBS缓冲液含有20mmol/L咪唑。本专利技术的第六方面提供一种靶向本专利技术第一方面所述的多肽的抗体的制备方法，其特征在于，包括利用所述多肽免疫家兔的步骤。本专利技术的第七方面提供本专利技术第六方面所述的抗体在制备用于检测无乳链球菌的试剂盒中的用途。本专利技术的有益效果1.利用本专利技术构建的基因工程载体，表达AP1-AP2-BP重组蛋白的产量高，不产生包涵体，易于回收。2.利用本专利技术的蛋白纯化方法，AP1-AP2-BP重组蛋白回收率高，且具有较好的免疫原性。3.利用本专利技术制备抗体的方法得到的抗体，可用于检测无乳链球菌，具有较高的敏感性和特异性。附图说明图1显示了表达产物AP1-AP2-BP重组蛋白的SDS-PAGE分析。M：低分子质量蛋白Marker(116～18Ku)；1：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌；2：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP基因串联重组工程菌；3：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎沉淀；4：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清。图2显示了抗体滴度的检测。图3显示了不同浓度硫酸铵对AP1-AP2-BP重组蛋白的粗提的影响。1：IPTG诱导后三基因串联重组工程菌破碎上清；2：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3-5：15％、20％、25％硫酸铵粗提AP1-AP2-BP重组蛋白；6：低分子量蛋白Marker；7-11：30％、35％、40％、45％、50％硫酸铵粗提AP1-AP2-BP蛋白。图4显示了不同悬浮缓冲液对AP1-AP2-BP蛋白的粗提的影响。1：低分子量蛋白Marker；2：pH值为8.5浓度为50mmol/L的Tris-Cl缓冲液的悬浮液；3：20mmol/LPBS缓冲液且含有20mmol/L咪唑的悬浮液；4：20mmol/LPBS缓冲液作为悬浮液。图5显示了最优条件的AP1-AP2-BP蛋白纯化。M：低分子量蛋白Marker；1：硫酸铵粗提后样品；2：上样；3-4：250mmol/L咪唑洗脱收集；5，硫酸铵粗提前样品。图6显示了血清中IgG纯化的结果。1：低分子量蛋白Marker。2，3：纯化后IgG。图7显示了IgG检测的ROC曲线。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本专利技术的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本专利技术所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的专利技术的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1重组蛋白的表达1材料与方法1.1载体将AP1、AP2、BP基因的PCR产物经相应酶处理后，分别与经同样酶切处理的表达载体进行连接，并转化于相应的BL21(DE3)宿主菌感受态细胞。提取质粒DNA，经双酶切鉴定筛选阳性重组质粒，同时将疑似阳性重组子进行测序。1.2实验动物及主要试剂10×PCRBuffer、T4连接酶、羊抗鼠IgG-HRP等均购自TaKaRa公司；质粒纯化试剂盒、DNA/PCR产物清洁试剂盒购自维特洁生化技术有限公司。1.3AP1、AP2、BP主要抗原域的预测、PCR融合扩增及重组表达载体的构建根据GenBank中无乳链球菌基因序列(EU930008)，采用DNAStarProtean功能分析AP1、AP2、BP基因抗原表位优势区，设计3对分别扩增3个亚基抗原域序列引物(表1)。*斜体黑子为引入的柔性序列利用重叠PCR技术，AP1F引物和BPR引物技术获得AP1-AP2-BP串联融合片段，并将该片段连接到pET-30a(+)载体上，得到pET-30a(+)AP1-AP2-BP重组表达载体。1.4重组蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定将测序正确的pET-30a(+)AP1-AP2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:8的氨基酸序列组成。2.一种基因，其特征在于，包括SEQIDNO:7所示的核苷酸序列或由SEQIDNO:7所示的核苷酸序列组成。3.一种基因工程载体，其特征在于，包括权利要求2所述的基因。4.一种基因工程细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的基因工程载体。5.权利要求3所述的基因工程载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得无乳链球菌核酸样本；(2)利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:6所示引物对步骤(1)获得的样本进行扩增；(3)步骤(2)扩增产品经回收纯化后连接到线性化的基因工程载体上。6.权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，包括将权利要求3所述基因工程载体转化进原核表达细胞中并诱导所述基因工程载体表达的步骤。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：布日额，吴金花，王金良，锡林高娃，
申请(专利权)人：内蒙古民族大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15