本发明专利技术在正常和突变型的结直肠癌细胞系中观察到PD‑L1的三个不同的可变剪接体的表达，通过构建三个剪接体的真核表达载体，转染不表达或低表达PD‑L1的肿瘤细胞中，发现isoform c促进了肿瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭，提示isoform c促进肿瘤的发生发展，是潜在的肿瘤诊断和治疗靶点以及肿瘤不良预后的监测靶点；同时，本发明专利技术还发现isoform b过表达的肿瘤细胞系与免疫细胞共培养时，促进了免疫细胞的凋亡，抑制了免疫细胞细胞因子的分泌，提示其具有抑制患者体内免疫反应，是肿瘤不良预后的监测靶点。
【技术实现步骤摘要】
PD‐L1剪接体c作为预测肿瘤预后靶标的应用
本专利技术涉及一种PD-L1剪接体在指导肿瘤免疫治疗用药中的应用，属于生物医药领域，具体为肿瘤的免疫治疗领域。
技术介绍
近年来，抗程序性死亡生长因子-1(programmeddeath-1，PD-1/CD279)/程序性死亡配体-1(programmeddeathligand-1，PD-L1/CD274)通路的免疫检查点阻断剂是抗肿瘤治疗的研究热点。目前已有Atezolizumab、nivolumab、pembrolizumab等试剂应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌(colorectalcancer，CRC)等恶性肿瘤的临床试验，并且取得了一定的治疗效果[1]。其中，结直肠癌为世界第三大高发癌症，且其致死率居恶性肿瘤第四位，对其适用的诊疗研究迫在眉睫。PD-L1作为潜在的CRC诊疗指标，已有较多研究对其蛋白表达水平进行检测，以期探究PD-L1与CRC间存在的关联。早在2013年，Shi等就对143例CRC患者样本进行免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测。结果显示，PD-L1在CRC中呈高表达，且与细胞分化程度及TNM分期有关，甚至可作为判断预后的独立因素[2]。之后，Matthew等对181例CRC患者IHC样本进行更为细致的分析。研究进一步证实了，PD-L1高表达状态与肿瘤的分期分型及预后相关[3]。同时，大量研究结合CRC患者的PD-L1表达水平与预后情况进行了相关性的统计学分析。Zhu等以结直肠锯齿状腺癌为研究对象，分析了120例IHC样本后发现，PD-L1高表达率为25％，且该部分患者预后较差[4]。而近期的其它研究还表明，肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltratingimmunecells，TILs)内的PD-L1表达量越高，患者的无病生存期越短、预后越差[5-7]。与此一致的是，在RoyS等针对抗PD-L1单抗药物MPDL3280A的研究中，PD-L1在IHC中的表达量(尤其是在TILs中)与患者的疾病缓解率成正比[8]。除此之外，Tony等的研究还证实，错配修复缺失型患者(mismatchrepair-deficient，MMR-D)的PD-L1表达量要高于错配修复完善型患者(mismatchrepair-proficient，MMR-P)，这将有助于筛选出可进行免疫治疗的适用患者[9]。不仅如此，PD-L1表达量还与CRC肿瘤微环境中的调节性T细胞数量[10]、肿瘤的各项病理参数及基因突变情况等相关[11]。总体而言，对PD-L1蛋白水平进行及时和准确的检测对指导CRC患者的治疗非常有利。现有技术中已经公开了PD-L1存在三个可变剪接体(isoform)，即Isoforma，Isoformb，Isoformc，但是仅仅公开了三个剪接体的存在，未曾有研究表明三个剪接体在体内的作用及其机理，也未有研究表明其在一种具体癌症中的作用。本专利技术的技术方案首次在肿瘤细胞中发现了PD-L1可变剪接体的作用，以及讲所述的作用机理应用与肿瘤免疫治疗的用药。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，是发现了在结直肠癌细胞系中差异表达的PD-L1。在一个具体的实施例中，所述的结直肠癌细胞系是RKO，差异表达的PD-L1的细胞系中是RKO-MUT(由浙江大学医学院病理学与病理生理学实验室保存，承诺向公众20年内免费提供)。在另外一个具体的实施例中，所述的差异表达是指采用RNAi干扰后，PD-L1在RKO-MUT细胞系中与RKO细胞系中的分子量差异，具体如图2所示。本专利技术的另一个方面是检测了结直肠癌细胞系中PD-L1各个变异体的表达情况。在一个具体的实施例中，所述的结直肠癌细胞系是RKO细胞与RKO-MUT细胞；在另外一个具体的实施例中，所述的检测RT-qPCR检测，结果如图4所示。本专利技术的另外一个方面是构建了PD-L1的三个变异体的表达载体。在一个具体的实施例中，所述的表达载体是pcDNA3.1(+)。在一个具体的实施例中，所述的isoforma的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示；在另外一个具体的实施例中，所述的isoformb的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示；在另外一个具体的实施例中，所述的isoformc的核苷酸序列为SEQIDNO:5所示。本专利技术的另外一个方面是将上述构建的表达载体转染到了不表达或低表达PD-L1的肿瘤细胞系中，并进行瞬时表达后观察所述的变异体在细胞内表达情况。在一个具体实施例中，所述的肿瘤细胞系为结直肠癌细胞，优选为HT29，HCT116；在一个具体的实施例中，检测HT29细胞系中isoforma/b/c的表达；在一个具体的实施例中，检测HCT116细胞系中isoforma/b/c的表达，具体如图4所示。本专利技术的另外一个方面是发现在肿瘤细胞系中表达PD-L1剪接体后，细胞行为学的变化。在一个具体的实施例中，所述的肿瘤细胞系是结直肠癌细胞系，优选为HT29，HCT116；在一个具体的实施例中，肿瘤细胞系在表达isoformc后，促进了细胞系的增殖，迁移以及侵袭，优选的，所述的肿瘤细胞系为结直肠癌细胞系，优选为HT29,HCT116，结果如图5所示。本专利技术的另外一个方面，对结直肠癌患者的组织cDNA样本进行基因表达的荧光定量PCR检测，并对样本来源病理进行随访，统计分析不同的剪接体与5年生存的关系，结果发现，高表达isoformb和isoformc的结直肠癌患者的5年生存率与低表达组具有明显的统计学差异，提示isoformb和isoformc是结直肠癌肿瘤患者不良预后的标志物，结果如图6所示。附图说明图1本领域已经公开的PD-L1的三个间接体的关系，图1a是显示PD-L1的三个变异体的序列长度，图1b是三个变异体的序列对比，其中中间部分是共同的序列。图2将Isoforma，Isoformb，Isoformc的CDS区域分别构建至pcDNA3.1(+)过表达载体。pcDNA3.1(+)载体信息示意图。图3通过Western-Blot方法检测PD-L1的在RKO,RKO-MUT细胞系中的表达情况，其中图3a是检测了结直肠癌常见细胞系的PD-L1的表达情况，发现在RKO,RKO-MUT中PD-L1是高表达的，其他细胞系不表达；图3b是经过siRNA干扰后的RKO/RKO-MUT的PD-L1表达情况，发现在RKO-MUT细胞系中RNAi后的蛋白条带无论从表达量还是条带位置均与RKO细胞系有较大差别。图4通过RT-qPCR的方法检测结直肠癌细胞系中PD-L1各个剪接体的mRNA转录情况。图5pcDNA3.1(+)的表达载体转染HT29/HCT116细胞后的三个剪接体的表达情况，图5a是HT29的三个剪接体的表达情况，图5b是HCT116的三个剪接体的表达情况。图6pcDNA3.1的表达载体转染HT29/HCT116的细胞后细胞行为的变化，图6a显示了表达isoformc后促进了HT29细胞的增殖，迁移以及侵袭；图6b显示了表达isoformc后促进了HCT116细胞的增殖，迁移以及侵袭。图7临床样本检测与结直肠癌5年生存率的关系，其中isoformb和isoformc高表达的病例与低表达病例在5年生存率上有本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.PD‐L1可变剪接体c(isoform c)在制备肿瘤不良预后靶标的应用。
【技术特征摘要】
1.PD‐L1可变剪接体c(isoformc)在制备肿瘤不良预后靶标的应用。2.根据权利要求1所述的应用，当isoformc高表达时，所述的肿瘤具有不良预后。3.权利要求2所述的应用，其中所述的高表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红河，王超彦，翁梦涵，来茂德，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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