一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法：均质处理的鱼肉，用乙酸乙酯萃取，正己烷净化，乙腈浓缩，外标法定量，高效液相色谱串联质谱法检测。本发明专利技术提出了一种快速筛选合格乙酸乙酯的方法，以避免可能存在的能氧化阿苯达唑的杂质。本方法中阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的检测限分别为0.27、0.09和0.11μg/kg。欧盟和中国对阿苯达唑在反刍动物中的最高残留限量规定，残留标志为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜总和，在肌肉基质中不得超过100μg/kg。因此本方法十分适用于检测鱼肉中阿苯达唑的残留，具有简单快速、成本低、灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法本专利技术涉及一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，属于环境保护

技术介绍
阿苯达唑(ABZ)是一种高效广谱驱虫药，被广泛应用于包括水产养殖业在内的多个领域。在生物体内，阿苯达唑会迅速代谢为3个主要代谢物：阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)，阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑氨基砜(ABZ-NH2-SO2)。它的驱虫活性主要决定于它的一级代谢物ABZ-SO，ABZ-SO也可以单独作为驱虫药使用。动物试验研究发现了ABZ和ABZ-SO都存在致畸效应。有文献提出，在服用ABZ后的初始阶段，生物体内最可能被检测到的残留是ABZ-SO和ABZ-SO2，残留时间最长的是ABZ-NH2-SO2。目前各国家机构、国际组织已有的对阿苯达唑最高残留限量(MRL)的定义，残留标志存在一定的争议。欧盟和中国对ABZ在反刍动物体内最高残留限量(MRL)的定义，以ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总和作为ABZ的残留标志，肌肉基质中MRL为100μg/kg。乙酸乙酯被许多研究者认为是从高蛋白质鱼肉基质中提取苯并咪唑类残留最合适的溶剂，目前涉及使用乙酸乙酯提取ABZ的文献中，乙酸乙酯中可能存在引起ABZ大量氧化成ABZ-SO的杂质并没有被报道。目前国内已有的标准方法和近10年的文献方法中，检测动物产品中阿苯达唑类残留主要的前处理方法是固相萃取法(SPE)和液-液萃取法(LLE)。固相萃取法操作复杂，成本高昂。内标物，尤其是同位素内标的引入更加重了检测成本，不利于推广。多数文献在同时检测几十甚至上百种兽药的时候，没有良好匹配相关国家机构或国际组织对阿苯达唑MRL的规定。因此，为了预防鱼肉中ABZ残留给人类带来的健康风险，如何开发一种普适性高、成本低廉、简单快速、灵敏度高的检测方法是目前迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，参考欧盟、中国的MRL法规，以代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总和作为ABZ的残留标志，规定鱼肉基质中最高残留限量不超过100μg/kg，提供一种普适性高、成本低廉、简单快速、灵敏度高的检测方法。为解决上述技术问题，提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，包括以下步骤：S1、称取2g均质鱼肉放入50mL离心管，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；S2、重复S1中的提取过程，合并上清液，旋蒸至干；S3、旋蒸瓶内的残留物，用1mL有机溶剂溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；S4、用2mL除脂溶剂分两次洗涤旋蒸瓶，溶液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂；S5、吸取700μL的下层清液，氮吹至干，用等体积的水溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，用液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。上述的方法，优选的，所述S1步骤中所述筛选合格乙酸乙酯的步骤具体为：S1-1,、将30mL乙酸乙酯放入100mL旋蒸瓶，40℃旋蒸旋蒸至干；S1-2、用1mL标准工作液溶解，超声1min助溶，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱法(紫外检测器)检测，与等浓度标准工作液色谱图对照，色谱图没有明显差异则为筛选合格的乙酸乙酯。上述的方法，优选的，所述S1-1步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。上述的方法，优选的，所述S1-2步骤中，所述标准工作液为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的混合液。上述的方法，优选的，所述S2步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。上述的方法，优选的，所述S3步骤中，有机溶剂为乙腈。上述的方法，优选的，所述S4步骤中，除脂溶剂为正己烷。上述的方法，优选的，水溶液为20％乙腈水溶液。上述的方法，优选的，所述S5步骤中，外标法所用标准工作液中，溶质为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜，溶剂为20％乙腈水溶液。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，能快速筛选合格乙酸乙酯。乙酸乙酯被广泛认为是从高蛋白鱼肉中提取苯并咪唑类残留的最优溶剂，在它长期或不妥当储存中可能存在导致ABZ快速氧化成ABZ-SO的杂质目前尚无文献报导，本专利技术发现并填补了这一空白。(2)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，提取溶剂乙酸乙酯以及用以富集的乙腈不需要额外修饰，简化了前处理步骤。(3)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，富集溶剂采用与正己烷互不相容的乙腈。与甲醇相比，它不会发生乳化，与正己烷分层更明显。与极性较高的乙腈水溶液或甲醇水溶液相比，它可以很大程度保留极性更低的ABZ。对于同时检测ABZ和它的代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2来说，有重要的指导意义。(4)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，定量方法采用外标法。同位素内标物是最合适的内标，但是通常不容易得到且成本高昂不利于推广。在能准确定量的前提下，本专利技术可以降低检测成本，进一步简化前处理步骤。(5)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，除脂溶剂采用正己烷，和C18、PSA、硅藻土、中性氧化铝和NH2净化粉末相比，它可以显著提高ABZ-NH2-SO2的回收率，减少目标分析物被净化剂吸附导致的损失。ABZ-NH2-SO2是被目前已有ABZMRL法规的全部国家机构、国际组织公认的残留标志或残留标志之一。(7)本专利技术提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，检测仪器采用LC-MS/MS，对ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的检测限分别为0.27、0.09和0.11μg/kg，总检测限为0.47μg/kg，灵敏度非常高可充分满足实际检测需求。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为阿苯达唑在生物体内的代谢路线图。图2为实施例1中阿苯达唑发生氧化代谢行为的色谱图。图3为实施例2中筛选合格乙酸乙酯的色谱图。图4为实施例3中验证正己烷中存在大量阿苯达唑的色谱图。图5为实施例4中的除脂步骤中30％乙腈水溶液pH对阿苯达唑回收率的影响说明。图6为实施例5中除脂步骤中有机溶剂比例对阿苯达唑回收率的影响说明。图7为实施例6中不同净化剂对阿苯达唑及三种主要代谢物回收率的影响说明。图8为实施例7中的前处理流程图。图9为实施例7中液相色谱串联质谱法中阿苯达唑代谢物的色谱图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而限制本专利技术的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售实施例1一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，发现从高蛋白基质中提取苯并咪唑类的常用提取剂乙酸乙酯存在能快速氧化ABZ为ABZ-SO的杂质，包括以下步骤：(1)样品a的制备取7.5mL乙酸乙酯放入15mL聚丙烯离心管，常温氮吹至干，加入1mL500μg/L混合标准工作液(含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、称取2g均质鱼肉放入50mL离心管，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；S2、重复S1中的提取过程，合并上清液，旋蒸至干；S3、旋蒸瓶内的残留物，用1mL有机溶剂溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；S4、用2mL除脂溶剂分两次洗涤旋蒸瓶，溶液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂；S5、吸取700μL下层清液，常温氮吹至干，用等体积的极性溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，用液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。

【技术特征摘要】
1.一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、称取2g均质鱼肉放入50mL离心管，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；S2、重复S1中的提取过程，合并上清液，旋蒸至干；S3、旋蒸瓶内的残留物，用1mL有机溶剂溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；S4、用2mL除脂溶剂分两次洗涤旋蒸瓶，溶液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂；S5、吸取700μL下层清液，常温氮吹至干，用等体积的极性溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，用液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述筛选合格乙酸乙酯的步骤具体为：S1-1、将30mL乙酸乙酯放入100mL旋蒸瓶，40℃旋蒸至干；S1-2、用1mL一定浓度的标准工作液溶解，超声1min助溶，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋相志，张燕飞，苏远安，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43