一种多色荧光标记样本的塑性包埋方法技术

本发明专利技术公开一种多色荧光标记样本塑性包埋方法，包括：将生物样本进行预处理；将预处理后的生物样本依次放入不同质量浓度的SBB和DTT的树脂溶液中进行梯度渗透，每个浓度0.5‑3小时，随后再次放入新鲜的加入SBB和DTT的树脂溶液中继续渗透6‑12小时；用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋、加热后得到包埋的荧光标记样本。本发明专利技术提供的包埋方法适用于多种树脂包埋，同时能适用于多种颜色荧光标记样本。

【技术实现步骤摘要】
一种多色荧光标记样本的塑性包埋方法
本专利技术涉及一种生物工程
，具体涉及一种多色荧光标记样本塑性包埋方法。
技术介绍
目前，通过荧光标记技术，能在一个样本上同时标记出各种信息，对深入研究生物体的结构和功能具有重要作用。现有的树脂包埋方法，采用纯树脂或者溶解SBB的树脂样本渗透包埋荧光生物组织，可获得背景荧光减少的样品，它的不足之处在于：这种包埋方法只适用于绿色荧光蛋白标记的生物组织，不适用于其他荧光(例如红色荧光蛋白、各种荧光素类探针等)标记，从而大大限制了其应用，例如图1所示。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种能适用于多种颜色荧光标记样本的包埋方法。为解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为采用一种多色荧光标记样本塑性包埋方法，包括：将生物样本进行预处理；将预处理后的生物样本依次放入0.5-0.7wt％DTT的梯度浓度的酒精溶液中进行渗透，每个浓度0.5-3小时，随后在不同质量浓度的树脂溶液中继续渗透6-12小时，所述不同浓度的树脂溶液包括0.1-0.2wt％的SBB和0.7-1wt％的DTT；用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋、加热后得到包埋的荧光标记样本。优选的，所述对生物样本进行预处理包括：将生物样本在多聚甲醛固定液中固定12-24小时；将固定后的生物样本在漂洗液中漂洗6-12小时；将所述漂洗后的生物样本依次放入冰水预冷却的50％、70％和95％或100％乙醇溶液中进行梯度脱水，每次5分钟到2小时。优选的，所述不同浓度的树脂溶液的质量浓度为40％～60％、60％～70％、70～90％和90％～100％。优选的，所述不同浓度的树脂溶液的质量浓度分别为50％、70％、85％和100％。优选的，所述梯度浓度酒精溶液的质量浓度分别为50％、70％、85％和100％。优选的，所述用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋具体为：将梯度渗透后的生物样本放置于包埋模具中，随后在模具中充满树脂渗透液。优选的，所述树脂渗透液和树脂溶液中的树脂具体为GMA树脂。优选的，加热后得到包埋的荧光标记样本具体为：将所述填充后的模具在35℃-40℃下加热12到24小时。优选的，所述树脂溶液的溶剂为95％乙醇。优选的，所述生物样本选自可发射荧光的动物组织。本专利技术的首要改进之处为提供了一种多色荧光标记样本的塑性包埋方法：该方法使用DTT进行渗透，并且使用较低的聚合温度能够使动物组织完全保持原有的荧光信号，同时使用SBB溶液进行渗透和较低的聚合温度能够显著降低树脂包埋生物样本的背景荧光，且渗透过程较为简便，能够适用于各种尺寸的生物样本；并且由于先进行了梯度的渗透，再进行包埋使得样品具有一定硬度，能满足连续薄切片；能够保持生物组织的抗原活性；所得包埋的生物样本能应用于块面成像结合连续薄切片的技术上，可用于快速获取荧光蛋白标记组织的高分辨三维荧光分布，继而进行相关结构和功能研究。附图说明图1为传统树脂包埋方法制备的脑组织tdTomato红色荧光蛋白成像结果；图2为本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织tdTomato红色荧光蛋白成像结果；图3是本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织mCherry红色荧光蛋白成像结果；图4是本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织DsRed红色荧光蛋白成像结果；图5是本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织绿色荧光蛋白(GFP)成像结果；图6是本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织蓝色荧光蛋白(BFP)成像结果；图7是本专利技术实施例2包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的心脏组织中tdTomato红色荧光蛋白成像结果；图8是本专利技术实施例3包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脊髓组织中红色荧光素成像结果。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。名词解释：GMA树脂：甲基丙烯酸缩水甘油酯。DTT：二硫苏糖醇。SBB：苏丹黑B下面通过具体的实施实例对本专利技术的技术发案作进一步的描述。实施例1对成年VIP::Ai14杂交小鼠使用1％戊巴比妥钠麻醉，采取心脏灌注的方式进行灌流，先灌注37℃的0.01MPBS溶液3-7分钟，之后灌注冰水预冷的4％多聚甲醛固定液7-10分钟。心脏灌注结束后，取小鼠脑组织，放入4％多聚甲醛固定液中，在4℃环境下后固定6-24小时。所述4％多聚甲醛固定液，是由4％多聚甲醛和2.5％蔗糖，溶在0.01MPBS中配制而成。将后固定好的脑组织放入冰水预冷的0.01MPBS中漂洗12-24小时，其间更换新的漂洗液3-5次，彻底清洗掉组织中的固定液。漂洗结束后，将脑组织依次放入冰水预冷加入0.5％-0.7％DTT的50％、70％和95％乙醇溶液中，进行梯度脱水，每次1-2小时。脱水结束后，将脑组织依次放入加入0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT的50％、70％、85％和100％的GMA溶液中梯度渗透，每个梯度2-3小时，其中，50％、70％和85％GMA渗透液的溶剂为95％乙醇；随后，再将脑组织放入新鲜的加入0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT的100％树脂溶液中渗透12-24小时；最后放入加入0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT预聚GMA包埋液中渗透2-3天。所有步骤在4℃下进行。其中，上述使用的100％GMA由52.3％GMA单体、3％水、44.1％甲基丙烯酸丁酯和0.6％偶氮二异庚腈配制而成；预聚GMA溶液的配制方法为：取100％GMA溶液搅拌加热至82℃，当产生大量气泡时，迅速放入冰水浴中摇动，使溶液快速冷却，形成类似于粘糖浆状的预聚物。将渗透结束的脑组织放入聚合模具中，在模具中加满含有0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT的预聚GMA包埋液，放置在真空烘箱中，抽真空除去模具中的氧气，调整烘箱至38℃，聚合12-24小时。聚合好之后，得到的脑组织包埋样本是高信噪比的荧光样本。对包埋好的脑组织进行tdTomato荧光成像，所得荧光图像参照图2。使用同样的实施方式，改用mCherry/dsRed/GFP/BFP标记的脑组织，可得到同样效果的图像，参照图3-6。实施例2取tdTomato标记的小鼠心脏组织，放入4％多聚甲醛固定液中，在4℃环境下后固定6-24小时。所述4％多聚甲醛固定液，是由4％多聚甲醛和2.5％蔗糖，溶在0.01MPBS中配制而成。将后固定好的心脏组织放入冰水预冷的0.01MPBS中漂洗12-24小时，其间更换新的漂洗液3-5次，彻底清洗掉组织中的固定液。漂洗结束后，将心脏组织依次放入冰水预冷加入0.5％-0.7％DTT的50％、70％和95％乙醇溶液中，进行梯度脱水，每次0.5-1小时。脱水结束后，将心脏组织依次放入含有0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT的50％、70％、85％和100％的GMA溶液中梯度渗透，每个梯度1-2小时，其中，50％、70％和85％GMA渗透液的溶剂为95％乙醇；随后，再将心脏组织放入新鲜的加入0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％DTT的100％树脂溶液中渗透6-12小时；最后放入加入0.1％-0.2％SBB和0.7％-1％D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多色荧光标记样本塑性包埋方法，其特征在于，包括：将生物样本进行预处理；将预处理后的生物样本依次放入0.5‑0.7wt% DTT的梯度浓度的酒精溶液中进行渗透，每个浓度0.5‑3小时，随后在不同质量浓度的树脂溶液中继续渗透6‑12小时，所述不同浓度的树脂溶液包括0.1‑0.2wt%的SBB和0.7‑1wt%的DTT；用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋、加热后得到包埋的荧光标记样本。

【技术特征摘要】
1.一种多色荧光标记样本塑性包埋方法，其特征在于，包括：将生物样本进行预处理；将预处理后的生物样本依次放入0.5-0.7wt%DTT的梯度浓度的酒精溶液中进行渗透，每个浓度0.5-3小时，随后在不同质量浓度的树脂溶液中继续渗透6-12小时，所述不同浓度的树脂溶液包括0.1-0.2wt%的SBB和0.7-1wt%的DTT；用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋、加热后得到包埋的荧光标记样本。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对生物样本进行预处理包括：将生物样本在多聚甲醛固定液中固定12-24小时；将固定后的生物样本在漂洗液中漂洗6-12小时；将所述漂洗后的生物样本依次放入冰水预冷却的50%、70%和95%或100%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次5分钟到2小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同浓度的树脂溶液的质量浓度为40%~60%、60%~70%、70~90%和90...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚辉，李向宁，任淼，田娇娇，
申请(专利权)人：华中科技大学苏州脑空间信息研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32