一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，属于花粉管加载荧光染料技术领域。所述利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，包括如下步骤：步骤1：原料预处理；步骤2：制备Fluo 4‑AM母液；步骤3：制备花粉悬浮液；步骤4：制备Fluo 4‑AM工作液；步骤5：制备加载荧光染料的花粉管。本发明专利技术在不影响花粉细胞结构和活性的情况下，采用负压渗透及染色剂染色，在低温下对花粉管进行处理，能够对花粉管中钙离子成功染色。

【技术实现步骤摘要】
一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法
本专利技术涉及一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，属于花粉管加载荧光染料

技术介绍
植物细胞中游离的Ca2+和其结合的蛋白质是植物信号网络内重要的组成者和参与者，植物细胞质中Ca2+的变化受环境刺激，与细胞的发育和生长又密切相关。在植物受刺激的情况下，细胞质中的Ca2+浓度很容易发生短暂的变化，另外花粉管尖端伸长过程中，需要胞外Ca2+向内流动维持尖端的Ca2+梯度，但目前关于Ca2+流动机制尚不甚清楚，因此探究一种可以用来准确反映植物细胞内Ca2+浓度变化的试验方法就显得尤为重要，这有助于进一步了解Ca2+在细胞内的功能。Ca2+的荧光成像技术是一种比较直观的有效用来研究细胞内Ca2+作用的方法。植物细胞中的Ca2+荧光成像主要有两种：一种是基于基因编码的绿色荧光蛋白为Ca2+指示剂，但此种方法需进行基因转化，耗时太长；另一种是具有荧光的有机小分子探针。常采用的小分子探针是Flou-3，Flou-4等，这些试剂不容易适过脂质的细胞膜。为了透过膜，荧光试剂前加一个脂头，但是细胞膜上有脂酶，在常温下易去掉这个脂头，而使荧光试剂不易透过细胞膜，因此有大量关于荧光试剂如何透过细胞膜，进入细胞内与钙结合产生荧光的研究。Ca2+依赖荧光信号很大程度上依赖于染料加载的方法，为促进这些小分子探针进入植物细胞，一种方法是通过显微注射的方法直接将探针注入细胞内，但这种发法对设备仪器的要求比较高，不利于广泛使用。另一种比较常用的方法是低温装载法，可避免细胞中的酯酶的酶解作用，但耗费时间偏长，一般需要过夜等。目前最成功和广泛使用的技术是将荧光探针直接微注射到植物细胞的细胞质中，但这种方法非常繁琐和耗时。其次是使用酯和酸类物质对植物原生质体进行非侵入性辅助加载，但由于原生质体失去了细胞壁和极性，它们的反应可能并不能准确反应其生理机制。用于检测花粉管细胞内Ca2+的染料或方法，在染色剂透过花粉细胞壁结合胞内Ca2+时大部分对花粉粒细胞结构造成伤害，使花粉失去活性。虽然目前存在许多荧光染料与具有细胞渗透性的乙酰甲酯结合透过细胞壁，结合激光共聚焦显微镜的使用可以检测不同刺激下植物细胞中Ca2+的空间分布变化的方法，但是这种方法又必须在低温条件下来避免细胞中酯酶对染色剂的酶解作用，加载时间较长，降低了试验效率。中国专利技术专利申请号为201510944828.7的《一种花粉管装载荧光染料的方法》，公开了一种花粉管装载荧光染料的方法。该专利技术专利采用细胞裂解液辅助装载，其缺点是裂解液的使用破坏了花粉细胞壁和细胞膜的结构使花粉细胞失去活力。综上，目前有许多关于使用负压渗透相关的报道，通过负压辅助的方法促进基因载体渗透进入细胞，在无植物组织培养和再生的情况下获得基因转化株。也有报道成功使用负压转化的方法进行不同种类植物的基因转化。在负压条件下，细菌可以渗透进入到植物的部分器官进行转化，可以显著提高转换效率。但目前并没有关于采用负压渗透的方法促进染色剂进入细胞进行染色的相关研究。鉴于此，有必要提出一种花粉管加载荧光染料的负压渗透方法，已解决现有技术的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术的不足，提供一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法。本专利技术在不影响花粉细胞结构和活性的情况下，采用负压渗透及染色剂染色，在低温下对花粉管进行处理，能够对花粉管中钙离子成功染色。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，包括如下步骤：步骤1：原料预处理在丰水梨花期，采集铃铛状的花朵，取下成熟花药，待花药开裂后收集花粉，置于密闭的硅胶瓶中，于-20℃条件下保存；步骤2：制备Fluo4-AM母液将50μg的Fluo4-AM溶解在91.2μL的无水二甲基亚砜中，于-20℃条件下避光密封保存，得到Fluo4-AM母液；步骤3：制备花粉悬浮液将步骤1中的-20℃条件下密闭保存的花粉于常温放置1-2h后，与培养液混匀至最终浓度为1×105-1×107个花粉/mL，于25℃条件下培养0.5-2h，得到花粉悬浮液；步骤4：制备Fluo4-AM工作液分别取1-5μL步骤2得到的Fluo4-AM母液和10-100μL步骤3得到的花粉悬浮液，混匀后，得到Fluo4-AM工作液；步骤5：制备加载荧光染料的花粉管将步骤4得到的Fluo4-AM工作液，于负压、低温条件下避光培养0.5-2h，再离心，弃去上清，用培养液洗涤2-3次，即得到加载荧光染料的花粉管。本专利技术的原理是：在负压条件下，细胞内的气体会从细胞内溢出，形成通道，利于荧光探针渗透通过质膜进入花粉管促进染色剂进入细胞，而且介质中各物质分子发生失重而四处飘游,增加了各分子间接触和碰撞的机会，使分子间的结合变得更加容易。另外，低温条件可以降低在植物细胞壁中存在的酯酶对AM的酶解作用使Fluo-4AM容易透过细胞壁加载到完整的植物细胞中，有效地克服了染料进入细胞前的水解问题。在此条件下染色剂更容易和花粉管中的Ca2+结合使反应加速完成，提高染色效果。由此可见，本专利技术通过使用负压渗透及染色剂染色，在低温下对花粉管进行处理，能够对花粉管中钙离子成功染色。其中，本专利技术的步骤1中，在丰水梨花期，采集铃铛状的花朵，是因为花药已经成熟，而花瓣尚未张开。收集的花粉，需要放入硅胶瓶中，于-20℃条件下密闭保存，是因为保持花粉干燥和降低花粉储藏温度可以减少花粉内物质消耗从而保持花粉的活性，有利于长期保存。本专利技术的步骤2中，Fluo4-AM是Fluo4的一种乙酰甲酯衍生物。Flou4-AM本身不具荧光，通过培养可以穿透细胞膜，AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Flou4足够敏感，当Flou4与Ca2+结合时荧光会增加100倍，可以检测和报告细胞内游离的低浓度的Ca2+。二甲基亚砜(DMSO)，是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。可用作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体，也可用作合成纤维的染色溶剂、去染剂、染色载体,以及回收乙炔、二氧化硫的吸收剂。本专利技术的Fluo4-AM和二甲基亚砜，均购自DojindoLaboratories，即日本株式会社同仁化学研究所。本专利技术的步骤3中，将步骤1中的-20℃条件下密闭保存的花粉于常温放置1-2h，是为了恢复至常温。本专利技术的步骤5中，得到加载荧光染料的花粉管后，可以采用激光共聚焦显微镜观察花粉管染色情况。检测时使用的激发波长为488nm，发射波长为500-550nm。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，步骤3和步骤5中，所述培养液均是将溶质溶解在30mM的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液中，其中，所述溶质为蔗糖、聚乙二醇、硼酸和硝酸钙的混合物；在所述培养液中，蔗糖的质量百分比为10％，聚乙二醇的质量百分比为20％，硼酸的质量百分比为0.01％，硝酸钙的质量百分比为0.03％。进一步，步骤5中，所述负压的压力为-50kPa至-100kPa，低温为0-4℃，所述离心的转速12000rpm，时间为1min。采用上述进一步的有益效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：原料预处理在丰水梨花期，采集铃铛状的花朵，取下成熟花药，待花药开裂后收集花粉，于‑20℃条件下密闭保存；步骤2：制备Fluo 4‑AM母液将50μg的Fluo 4‑AM溶解在91.2μL的无水二甲基亚砜中，于‑20℃条件下避光密封保存，得到Fluo 4‑AM母液；步骤3：制备花粉悬浮液将步骤1中的‑20℃条件下密闭保存的花粉于常温放置1‑2h后，与培养液混匀至最终浓度为1×105‑1×107个花粉/mL，于25℃条件下培养0.5‑2h，得到花粉悬浮液；步骤4：制备Fluo 4‑AM工作液分别取1‑5μL步骤2得到的Fluo 4‑AM母液和10‑100μL步骤3得到的花粉悬浮液，混匀后，得到Fluo 4‑AM工作液；步骤5：制备加载荧光染料的花粉管将步骤4得到的Fluo 4‑AM工作液，于负压、低温条件下避光培养0.5‑2h，再离心，弃去上清，用培养液洗涤2‑3次，即得到加载荧光染料的花粉管。

【技术特征摘要】
1.一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：原料预处理在丰水梨花期，采集铃铛状的花朵，取下成熟花药，待花药开裂后收集花粉，于-20℃条件下密闭保存；步骤2：制备Fluo4-AM母液将50μg的Fluo4-AM溶解在91.2μL的无水二甲基亚砜中，于-20℃条件下避光密封保存，得到Fluo4-AM母液；步骤3：制备花粉悬浮液将步骤1中的-20℃条件下密闭保存的花粉于常温放置1-2h后，与培养液混匀至最终浓度为1×105-1×107个花粉/mL，于25℃条件下培养0.5-2h，得到花粉悬浮液；步骤4：制备Fluo4-AM工作液分别取1-5μL步骤2得到的Fluo4-AM母液和10-100μL步骤3得到的花粉悬浮液，混匀后，得到Fluo4-AM工作液；步骤5：制备加载荧光染...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈海泳，李坤，马春晖，高超，王永章，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37