一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法，桥联黄素作为细胞内NAD(P)

【技术实现步骤摘要】
一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法
本专利技术涉及氧化还原反应，具体涉及一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法。
技术介绍
辅因子为生物合成与分解反应提供氧化还原载体，是细胞内能量传递的重要因子，由此可见辅因子在生物化学反应中具有重要的作用。辅因子NADH/NAD+和NADPH/NADP+作为细胞代谢中最重要的氧化还原载体，不仅能够作为催化底物分解代谢的电子受体，也能为能量依赖型的氧化还原反应提供还原力。因此，NADH/NAD+和NADPH/NADP+的氧化与还原速率平衡是维持正常合成代谢与分解代谢平衡的必然需求。通过合理控制胞内辅因子水平，能够使生物催化过程更加高效的进行。目前，较为常用的控制辅因子平衡的策略有以下三种：1)通过基因敲除或过表达某些基因等方法的内源辅因子平衡调控手段；2)通过引入外源再生辅因子酶等方法的外源辅因子平衡调控手段；3)通过蛋白质工程等方法改变辅因子的偏好性。另外一种比较新颖的策略是构建人工辅因子系统进行调控。人工辅因子相比天然辅因子有着稳定性高、易于制备、价格相对低廉，且在某些酶促反应中催化效率优于天然辅因子的特点，由此为调控辅因子平衡，提供了一种更加高效且价格更加低廉的途径。但是，对于人工辅因子的应用尚且停留在细胞外阶段，关于人工辅因子参与胞内代谢的应用仅有一例，赵宗保课题组使用人工合成的天然烟酰胺辅因子类似物——烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)构建了一种选择性的电子传递系统，该合成的烟酰胺辅因子类似物能够进入大肠杆菌细胞，被突变后能够识别该人工辅因子的苹果酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶利用，高效生产苹果酸。但是，这种基于人工辅因子的胞内系统，需要构建突变酶库以识别人工辅因子，需要过表达膜转运蛋白Ndt以运输人工辅因子进入胞内，因此该人工辅因子系统不具备广谱性，同样表达膜通道蛋白会对细胞产生毒性。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决细胞内辅因子水平不易调控影响氧化还原反应效率的问题，本专利技术提供了一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法。技术方案：本专利技术所述一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法，桥联黄素作为细胞内NAD(P)+再生催化剂，和细胞内依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化的氧化反应偶联，形成细胞内的NAD(P)+再生循环体系。专利技术人首次发现了桥联黄素可以在不改变细胞膜的通透性或者过表达膜蛋白的情况下进入细胞内部，加速细胞内NAD(P)+再生；其中NAD(P)+的再生需要在空气或氧气的氛围下完成。细胞内NAD(P)+再生的反应过程如下：细胞内依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化底物进行氧化反应，NAD(P)+被还原为NAD(P)H，以桥联黄素作为NAD(P)+再生催化剂，氧化NAD(P)H生成NAD(P)+，形成细胞内的NAD(P)+再生循环体系，辅助氧化还原酶连续催化底物进行氧化反应。本专利技术所述的NAD(P)+为NAD+或者NADP+；所述的NAD(P)H为NADH或者NADPH。具体地，催化体系包括全细胞、依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物、桥联黄素、缓冲液，所述催化体系催化依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物进行氧化反应。优选地，氧化反应完成后对催化体系进行固液分离，向得到的沉淀中补加依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物、缓冲液继续进行氧化反应，所述全细胞和桥联黄素重复使用3-8次。优选5次。另一种情况下，催化体系包括全细胞、桥联黄素、细胞培养液，所述细胞培养液中包括依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物，所述催化体系催化依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物进行氧化反应。氧化反应完成后对催化体系进行固液分离，向得到的沉淀中补加细胞培养液继续进行氧化反应，所述全细胞和桥联黄素重复使用3-8次。优选5次。优选地，所述全细胞选自大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞、酵母(Saccharomyce)细胞、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)细胞、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞、链霉菌(Streptomycetaceae)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、或上述细胞的重组细胞。更优选地，所述全细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞或重组大肠杆菌细胞；更优选为重组大肠杆菌MtDH-BL21、GlyDH-BL21。优选地，所述全细胞是利用相应细胞需要的液体培养基培养至对数期、稳定期或衰亡期的细胞；优选培养至对数期、稳定期的细胞。优选地，所述重组细胞为通过敲除细胞基因、表达内源基因或表达外源基因得到的重组细胞；优选表达外源基因、过表达内源基因的重组细胞。优选地，所述催化体系中全细胞的浓度为0.01-100g/L，优选5-50g/L，更优选10g/L。所述桥联黄素结构通式如下：其中，R1和R2相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R3选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X-选自：卤离子、硝酸根、三氟甲磺酸根离子。优选地，R1包括但不限于氢、甲基、卤原子；R2包括但不限于氢、甲基、卤原子、三氟甲基；R3包括但不限于氢、甲基；X-为卤离子。更优选地，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物Ⅱ)、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物Ⅲ)、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物IV)。最优选地，桥联黄素为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。本专利技术所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献[Tetrahedron,2001,57,4507-4522]；或者直接从市场上购买。所述催化体系中桥联黄素的浓度为0.001-10mM，更优选0.05-0.5mM，更优选0.1-0.5mM，最优选0.1mM。所述依赖NAD(P)+的氧化还原酶选自EC1.1.1.X、EC1.2.1.X、EC1.3.1.X、EC1.4.1.X、EC1.5.1.X、EC1.6.1.X、EC1.7.1.X、EC1.8.1.X、EC1.10.1.X、EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X的所有酶。底物由不同的氧化还原酶决定。优选地，所述依赖NAD(P)+的氧化还原酶为甘露醇脱氢酶、甘油脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A脱氢酶。优选地，所述催化体系中依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物的初始浓度为50-1000mM。优选地，所述催化体系还包括外源添加的NAD(P)+，所述外源添加的NAD(P)+的浓度为0.05-5mM。有益效果：(1)与现有基于人工辅因子系统的调控胞内辅因子平衡的技术相比，本专利申请不需要构建突变酶库识别人工辅因子，不需要表达对细胞会产生毒性的膜蛋白，适用性强，能够与胞内多种依赖NAD(P)+的氧化还原酶偶联，加速胞内NAD(P)+再生；(2)桥联黄素可以在不改变细胞膜的通透性或者过表达膜蛋白的情况下进入细胞内部，加速胞内烟酰胺辅因子再生；(3)本专利申请催化体系中的全细胞和桥联黄素可以保证产物得率的情况下重复利用3-8次；(4)与体外桥联黄素介导的酶促反应相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法，其特征在于，桥联黄素作为细胞内NAD(P)+再生催化剂，和细胞内依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化的氧化反应偶联，形成细胞内的NAD(P)+再生循环体系。

【技术特征摘要】
1.一种利用全细胞作为催化剂的氧化方法，其特征在于，桥联黄素作为细胞内NAD(P)+再生催化剂，和细胞内依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化的氧化反应偶联，形成细胞内的NAD(P)+再生循环体系。2.根据权利要求1所述的氧化方法，其特征在于，催化体系包括全细胞、依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物、桥联黄素、缓冲液，所述催化体系催化依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物进行氧化反应。3.根据权利要求2所述的氧化方法，其特征在于，氧化反应完成后对催化体系进行固液分离，向得到的沉淀中补加依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物、缓冲液继续进行氧化反应，所述全细胞和桥联黄素重复使用3-8次。4.根据权利要求1所述的氧化方法，其特征在于，催化体系包括全细胞、桥联黄素、细胞培养液，所述细胞培养液中包括依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物，所述催化体系催化依赖NAD(P)+的氧化还原酶的底物进行氧化反应。5.根据权利要求4所述的氧化方法，其特征在于，氧化反应完成后对催化体系进行固液分离，向得到的沉淀中补加细胞培养液继续进行氧化反应，所述全细胞和桥联黄素重复使用3-8次。6.根据权利要求1-5任意一项所述的氧化方法，其特征在于，所述全细胞选自大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞、酵母(Saccharomyce)细胞、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)细胞、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞、链霉菌(Streptomycetaceae)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、或上述细胞的重组细胞。7.根据权利要求6所述的氧化方法，其特征在于，所述全细胞是培养至对数期、稳定期或衰亡期的细胞。8.根据权利要求6所述的氧化方法，其特征在于，所述全细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞或重组大肠杆菌细胞。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱晨杰，曹阳，应汉杰，谭卓涛，陈勇，李明，庄伟，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32