CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法技术

技术编号:19478268 阅读:229 留言:0更新日期:2018-11-17 09:28
本发明专利技术公开了涉及一种CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法;包括如下步骤:确定notch1a基因敲除的靶点位置;以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7‑notch1a‑sfd、tracr rev进行PCR扩增;PCR产物纯化、体外转录获得gRNA;将gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼胚胎中,培养获得稳定遗传的notch1a突变体。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术,通过选择一段独特的打靶区,使得斑马鱼中的notch1a被敲除,又不“误伤”其他基因,形成notch1a基因敲除的斑马鱼;另外,本发明专利技术还公开了notch1a基因缺失斑马鱼突变体的表型,对于研究Notch信号通路中Notch1a受体的作用意义重大。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法
本专利技术涉及一种斑马鱼突变体,具体涉及一种通过CRISPR/Cas9技术制备notch1a突变体斑马鱼的方法及突变体表型的确定。
技术介绍
Notch信号通路被认为是在早期发育过程中以及多种细胞的功能行使中扮演着重要角色的通路。其主要作用包括细胞的增殖、分化以及干细胞的更新等。Notch受体高度保守,其功能的行使依赖于出现在邻近细胞上的特异性配体。在机体的发育过程、肿瘤细胞的形成及增殖过程和遗传病的调控方面Notch信号通路都发挥着重要作用。在神经系统中,Notch信号通路也具有广泛的调控作用,影响神经干细胞的分化及数量,同时还可以调节多种细胞的形成。CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats,CRISPR/CRISPR-associatedgenes,Casgene)系统是一种微生物的后天免疫系统,它利用向导RNA核酸酶对外源基因进行切割。CRISPR/Cas有三种类型:I型、II型和III型,其中II型只需要一个Cas9核酸内切酶切割DNA双链,即CRISPR/Cas9系统。该系统由Cas9核酸酶连同两种非编码性RNA,即CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA)共同组成。相比于其它的基因编辑技术,如ZFNs和TALENs,CRISPR/Cas9系统具有容易合成,打靶效率高和同时编辑多个基因的优势。CRISPR/Cas9系统的高效性不但确保了在体细胞内对基因进行突变,同时也能造成生殖细胞的突变,从而将突变基因传递到下一代。由于斑马鱼发育快,该系统对基因读码框序列破坏的高效性使得我们可以在短时间内建立稳定的可遗传的突变斑马鱼品系,这将有利于推动基因功能的研究。申请人发现在斑马鱼中Notch1a与哺乳动物中NOTCH1具有较高的相似性。利用基因敲除的突变体可以有效的研究Notch通路的相关功能。目前关于小鼠中Notch1突变体的研究不足,并且小鼠模型的构建及维护费用昂贵。而在斑马鱼上使用morpholino敲降notch1a并不能得到体节及节间血管紊乱的表型。斑马鱼notch1a基因位于21号染色体上,有3个转录本,其中最长的一个转录本mRNA全长7474bp,编码2438个氨基酸,含有33个外显子和32个内含子。如何选择一个有功能的靶点,使整个基因失去功能而且出现易于筛选的表型是十分困难的,犹如大海捞针。良好的打靶区的选择对于突变体的制备至关重要。并且,成功构建notch1a的突变体,并以此为模型研究早期发育中Notch通路的功能是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法及突变体表型的确定。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术选取第16个外显子上特异的打靶位点构建了notch1a的突变体。随机突变的结果共得到4种突变类型,分别为在靶点附近缺失4bp、10bp、19bp和31bp。对突变的序列进行氨基酸翻译发现均会形成蛋白翻译的提前终止,缺失4bp突变体会在947位氨基酸处出现翻译终止;缺失10bp突变体会在945位氨基酸处出现翻译终止;缺失19bp突变体会在942位氨基酸处出现翻译终止;缺失31bp突变体会在938位氨基酸处出现翻译终止。突变体会出现体节和节间血管紊乱的表型,而且这4种不同的突变体出现一致的表型特征。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术涉及一种斑马鱼notch1a基因突变体的制备方法,所述方法包括如下步骤:S1、确定notch1a敲除的靶点在斑马鱼notch1a的基因序列的第16个外显子上;S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物;S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板,使用引物T7-notch1a-sfd、tracrrev进行PCR扩增;S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录,纯化获得gRNA;S5、以pXT7-hCas9质粒为模板,体外转录合成Cas9mRNA;S6、将gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼一细胞期胚胎中;S7、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch1a突变体。优选的,步骤S1中,所述靶点序列为GGAGTGTGTGAAAACCTGCG(SEQIDNO.1)。优选的,步骤S2中,所述扩增引物为notch1aF:CGTGTGAGGTGGACATTA(SEQIDNO.4);notch1aR:CATTAGTTAAGTGAGGTGTGAG(SEQIDNO.5)。优选的,步骤S3中,所述引物T7-notch1a-sfd的序列为TAATACGACTCACTATAGGAGTGTGTGAAAACCTGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQIDNO.2)。优选的,步骤S3中,所述引物tracrrev的序列为AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQIDNO.3)。优选的,步骤S4中,所述gRNA的序列为T7启动子+靶位点+pUC19-gRNA固定序列,是使用T7-notch1a-sfd和tracrrev引物对,以pMD19-gRNAscaffold质粒为模板,使用高保真酶High-FidelityPCRMasterMixwithHFBuffer,电泳、切胶回收获得。优选的,步骤S5中,所述Cas9mRNA是通过包括如下步骤的方法制备而得:A1、pXT7-hCas9质粒线性化,用XbaI内切酶酶切质粒pXT7-hcas9;A2、酶切产物纯化,用DNAClean&ContentratorTM-5kit纯化试剂盒对上述酶切产物进行纯化;A3、体外转录Cas9mRNA,用mMESSAGEmMACHINET7ULTRAkit体外转录试剂盒对Cas9mRNA进行体外转录;A4、对得到的产物进行加尾后用Nanodrop2000C测浓度,并-80℃保存备用。优选的,步骤S6中,将gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼,具体为:将gRNA与Cas9mRNA混合,显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中;其中,gRNA终浓度为100ng/μL,Cas9mRNA终浓度为400ng/μL。优选的,步骤S7具体包括如下步骤:B1、对导入gRNA与Cas9mRNA的斑马鱼进行notch1a敲除检测,确定notch1aF0靶点突变效率;B2、将notch1aF0成鱼与野生型斑马鱼外交,得到F1胚胎;经基因型鉴定获得notch1aF1突变体斑马鱼;B3、将相同突变的notch1aF1突变体斑马鱼内交,获得notch1aF2突变体斑马鱼;B4、鉴定为F2中notch1a敲除的纯合子具有纯合致死的现象,F2中notch1a基因敲除的杂合子即所述稳定遗传的斑马鱼notch1a突变体。优选的,步骤B1中,notch1a敲除检测采用的引物序列为notch1aF:CGTGTGAGGTGGACATTA(SEQIDNO.4);notch1aR:CATTAGTTAAGTGAGGTGTGAG(SEQIDNO.5)。与现有技术相比,本专利技术具有如下有益效果:1、利用CRISPR/Cas9技术及一段特异的打靶位本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:S1、确定notchla基因敲除的靶点在斑马鱼notchla的基因序列的第16个外显子上;S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物;S3、以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7‑notchla‑sfd、tracr rev进行PCR扩增;S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录,纯化获得gRNA;S5、以pXT7‑hCas9质粒为模板,体外转录合成Cas9 mRNA;S6、将gRNA与Cas9 mRNA导入斑马鱼一细胞期胚胎中;S7、培养获得稳定遗传的斑马鱼notchla突变体。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:S1、确定notchla基因敲除的靶点在斑马鱼notchla的基因序列的第16个外显子上;S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物;S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板,使用引物T7-notchla-sfd、tracrrev进行PCR扩增;S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录,纯化获得gRNA;S5、以pXT7-hCas9质粒为模板,体外转录合成Cas9mRNA;S6、将gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼一细胞期胚胎中;S7、培养获得稳定遗传的斑马鱼notchla突变体。2.根据权利要求1所述的斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,步骤S2中,所述靶点序列为SEQIDNO.1所示的序列。3.根据权利要求1所述的斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述引物T7-notchla-sfd的序列为SEQIDNO.2所示的序列。4.根据权利要求1所述的斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述引物tracrrev的序列为SEQIDNO.3所示的序列。5.根据权利要求1所述的斑马鱼notchla突变体的制备方法,其特征在于,步骤S5中,所述Cas9mRNA是通过包括如下步骤的方法制备而得:A1、pXT7-hCas9质粒线性化,用XbaI内切酶酶切质粒pXT7-hCas9;A2、酶切产物纯化,用DNAClean&...

【专利技术属性】
技术研发人员:张庆华季策董雪红张秋月岳倩文李伟明
申请(专利权)人:上海海洋大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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