水稻白叶枯病菌PXO_03362基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻白叶枯病菌PXO_03362基因，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列，由1416个碱基组成，其编码的蛋白含471个氨基酸，在已公布全序列的XooPXO99

【技术实现步骤摘要】
水稻白叶枯病菌PXO_03362基因及其应用
本专利技术属于水稻白叶枯病菌致病相关基因
，尤其涉及一种水稻白叶枯病菌PXO_03362基因及其应用。
技术介绍
水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，简称Xoo)是世界水稻生产中危害严重的两种病害细菌性之一，分属于黄单胞菌属，其引发的水稻白叶枯病(Bacterialleafblight，简称BLB)对水稻的产量造成了较大的影响。该菌在水稻生长的整个时期均可侵染水稻，苗期、分蘖期受害尤为严重。水稻白叶枯病在世界各水稻产区均有发生，早在1884年发现于日本福冈地区，随后在朝鲜、印度、菲律宾等亚洲国家流行，除此之外，非洲、南美、澳大利亚也都有发生。进入21世纪后，尼日尔、西非马里等地种植的水稻也都曾因白叶枯病而减产。水稻白叶枯病在常年种植水稻的南亚和东南亚地区危害最为严重。在我国主要在南方和长江中、下游稻区常年发生流行，一般减产10％-30％，严重时减产可达50％。因此，对水稻白叶枯病菌的研究与防治有很大意义。病原微生物侵染宿主发生病害的过程，是由病原细菌与宿主植物各自的大量基因和生化因子相互作用的结果。通常将破坏寄主植物正常生理功能，导致植物致病，且由病原菌分泌合成的相关物质的基因称为致病相关基因。
技术实现思路
水稻白叶枯病菌PXO_03362基因，为序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。上述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因在研制防治水稻白叶枯病的生物农药或制备水稻白叶枯病菌或构建水稻白叶枯病模型中的应用。上述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因编码的蛋白质。上述蛋白质具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。上述蛋白质在研制防治水稻白叶枯病的生物农药或制备水稻白叶枯病菌或构建水稻白叶枯病模型中的应用。包含上述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因的重组载体。重组载体的原始载体为原核表达载体pLAFRJ。缺失上述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因的水稻白叶枯病菌的突变体菌，由包含水稻白叶枯病菌PXO_03362基因的重组载体的原始菌突变而来。依据致病相关基因编码的产物在侵染水稻发病过程中所起到的作用，专利技术人发现了一种新的水稻白叶枯病菌致病相关基因——水稻白叶枯病菌PXO_03362基因，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列，由1416个碱基组成，其编码的蛋白含471个氨基酸，在已公布全序列的XooPXO99A中的同源基因被注释为假定的分泌蛋白(putativesecretedprotein)，而本专利技术基因的尚未有文献报道。研究表明，该基因突变的水稻白叶枯病菌致病力显著下降，因此，本专利技术可以对水稻白叶枯病毒致病机理提供重要线索，PXO_03362基因可作为药物靶标研发生物农药、建立细菌和植物的疾病模型，研究水稻白叶枯病与植物的分子机制，用于研发抗病的药物，对水稻白叶枯病的生物防治有重要意义。据此构建的重组原核表达质粒载体，可在多种宿主细胞中高效表达。附图说明图1是PXO_03362基因编码蛋白的结构域分析图。图2是PXO_03362基因缺失突变体D03362的PCR验证凝胶图，图中：M：100bpPlusMarker；1、2用C03362F/R引物PCR验证结果，1：XooK74，2：D03362；3、4用03362F/R引物PCR验证结果，3：XooK74，4：D03362，。图3是PXO_03362基因突变体致病性试验结果照片。图4是PXO_03362基因突变体致病性试验的统计图，图中：**表示有与野生型XooK74相比有极显著差异，P＞0.01。具体实施方式以下通过实施例来充分说明本专利技术如何实施，所用材料包括：大肠杆菌DH5α为申请人保存；pK18mobsacB、pLAFRJ为专利技术人研究室保存的质粒；限制性内切酶、连接酶等试剂购自Promega公司；总DNA提取、质粒提取、PCR产物纯化和胶回收试剂盒购自Omega公司。实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，贺福初等译的《分子克隆实验指南》，第四版，科学出版社)实施例1PXO_03362基因编码蛋白的结构域与功能预测PXO_03362基因在同源的水稻白叶枯病菌XooPXO99A中被注释为假定的分泌蛋白(putativesecretedprotein)，尚未有相关的研究报道。专利技术人通过蛋白结构域预测网站SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)分析，pxo_03362所编码的蛋白含有两个结构域分别为NAD_Binding_9和FAD_Binding_2。NAD_Binding_9在所编码的肽链中的位置是8到152个氨基酸，总长145个氨基酸；FAD_Binding_2在所编码的肽链中的位置是300到433个氨基酸，总长134个氨基酸(见图1)，其中FAD_Binding_2结构域在一些和FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)结合的蛋白中被发现，例如来自延胡索酸和琥珀酸还原酶的黄素亚基，天冬氨酸氧化酶的黄素亚基和腺苷酰硫酸还原酶的α亚基。实施例2PXO_03362基因缺失突变体的构建。用强致病力水稻白叶枯病菌XooK74为出发菌株，将含有PXO_03362基因上、下游200bp片段整合至pK18mobsacB质粒上获得的重组质粒pKD03362的大肠杆菌过夜培养，提取重组质粒，制备XooK74的电转感受态，通过电转的方法将重组质粒pKD03362转入黄单胞菌XooK74中，借助同源单交换，质粒pKD03362可以整合到XooK74的基因组中，用Kan、Sm抗性板筛选，通过在含Sm的蔗糖板和含Kan、Sm抗性板上同时平行点板，进一步确认单交换子。将经确认过的单交换子转接至含Sm的OB培养基中，28℃摇床培养24h，稀释涂布在含Sm、10％蔗糖的OA板上，放置3-4d，此过程中，单交换子再次发生同源单交换，排除掉交换回野生型的菌株，得到失去PXO_03362基因的双交换子，即PXO_03362基因缺失突变体，其缺失突变体编号为D03362。实施例3PXO_03362基因的克隆及序列测定根据PXO_03362的基因序列，设计引物C03362F/R(序列为SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4所示序列)，以水稻白叶枯病黄单胞菌K74菌株总DNA为模板，PCR扩增该基因全长序列(95℃10min；95℃30sec；60℃30sec；72℃90sec，35个循环；72℃5min)，并将其克隆至克隆载体pK18mobsacB中，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。将测序验证正确的PXO_03362基因序列克隆至原核表达载体pLAFRJ中，获得了含该基因的重组质粒pJ03362。实施例4突变体D03362的PXO_03362基因互补菌株的构建将实施例3中构建的重组质粒pJ03362通过电转化的方式转到实施例2中构建的缺失突变体D03362中，获得D03362的互补菌株命名为CD03362。实施例5PXO_03362基因缺失突变体的验证对缺失突变体D03362进行PCR验证，提取D03362的总DNA作模板，用PXO_03362基因外部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻白叶枯病菌PXO_03362基因，其特征在于为序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.水稻白叶枯病菌PXO_03362基因，其特征在于为序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。2.权利要求1所述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因在研制防治水稻白叶枯病的生物农药或制备水稻白叶枯病菌或构建水稻白叶枯病模型中的应用。3.权利要求1所述水稻白叶枯病菌PXO_03362基因编码的蛋白质。4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。5.权利要求4所述蛋白质在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄胜，倪哲，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45