美洲大蠊断肢再生相关Wingless信号通路基因及其dsRNA的应用制造技术

本发明专利技术公开了美洲大蠊断肢再生相关Wingless信号通路基因及其dsRNA的应用，美洲大蠊断肢再生相关基因分别为Wg、Arr、Dsh，其中，Wg的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Arr的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，Dsh的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。通过设计靶向沉默美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA，可以实现对美洲大蠊的防治。

【技术实现步骤摘要】
美洲大蠊断肢再生相关Wingless信号通路基因及其dsRNA的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及美洲大蠊断肢再生Wingless信号通路相关基因及其dsRNA的应用。
技术介绍
蟑螂原产于非洲，生活场地较潮湿、温暖、黑暗；喜欢躲藏在隐蔽的缝隙中；活动时间集中在夜晚，因此人类较难消灭其种群。美洲大蠊为较为常见的一种蟑螂，为杂食性昆虫，能进食酸甜苦辣咸的食物、昆虫尸体等，比较喜欢吃甜食。在无水无食的情况下也能存活多日；同时美洲大蠊的破坏力很强，损坏衣物，传播疾病，是一种常见的家庭卫生害虫。美洲大蠊幼虫具有极强的附肢(腿和触角等)再生能力，生存能力极强，极难防治。从上世纪40年代开始，化学农药和有机杀虫剂在害虫防治实践中表现出高效的杀虫效果，为害虫防治带来了革命性改变。但随着其长期大量使用，农药残留、水源和环境污染、生物链中断、生态失衡等一系列负面问题日益凸显。目前市面用于蟑螂防治的产品主要以化学农药为主，随着人们对卫生环境重视的加强及蟑螂抗药性问题的出现，开发环境友好、高效、无毒的蟑螂防治方法成为攸关国家经济发展、社会进步和食品安全的关键问题。利用先进的生物防治技术(RNA干扰(RNAi))对害虫进行防治的探索正在不断增加。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何建立一种新型、安全、高效的美洲大蠊防治方法。本专利技术的技术方案为：美洲大蠊断肢再生相关基因，分别为Wg、Arr、Dsh三个基因，其中，Wg的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，Arr的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，Dsh的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。一组靶向沉默权利要求1所述的美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA，所述dsRNA有三个，分别靶向沉默Wg、Arr、Dsh三个基因，其中，靶向沉默Wg基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，靶向沉默Arr基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示，靶向沉默Dsh基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。上述所述的一组靶向沉默权利要求1所述的美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA的制备方法，靶向沉默Wg基因的dsRNA通过以下方法制备：将SEQIDNo.4所示的基因片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Wg，然后以pTOPO-Wg为模板，以两端含有T7启动子的引物SEQIDNo.7和SEQIDNo.8，进行PCR扩增，PCR产物通过T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem转录合成；靶向沉默Arr基因的dsRNA通过以下方法制备：将SEQIDNo.5所示的基因片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Arr，然后以pTOPO-Arr为模板，以两端含有T7启动子的引物SEQIDNo.9和SEQIDNo.10，进行PCR扩增，PCR产物通过T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem转录合成；靶向沉默Dsh基因的dsRNA通过以下方法制备：将SEQIDNo.6所示的基因片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Dsh，然后以pTOPO-Dsh为模板，以两端含有T7启动子的引物SEQIDNo.11和SEQIDNo.12，进行PCR扩增，PCR产物通过T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem转录合成。dsRNA靶向的美洲大蠊断肢再生相关基因的核苷酸序列分别如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示。含有SEQIDNo.4所示或SEQIDNo.5所示或SEQIDNo.6所示核苷酸序列的重组载体或重组菌。上述所述的一组靶向沉默上述所述的美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA在防治美洲大蠊中的应用。注射上述所述dsRNA到美洲大蠊体腔，结果表明合成的dsRNA可以特异性地沉默美洲大蠊Wg、Arr、Dsh基因的mRNA表达，并导致美洲大蠊出现断肢再生障碍。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对美洲大蠊具有顽强的断肢再生能力而很难防治的现状设计害虫防治方案，即可以高效除害，又避免了环境污染，安全可靠。蟑螂断肢再生的一个重要过程就是再生腿的塑型，而wingless信号通路包括多个重要的成形素基因，如Wg、Arr和Dsh等，该通路的缺失将使得蟑螂无法进行正常的附肢再生，利用其重要生物学功能来进行害虫防治，省时省力，安全高效。附图说明图1：美洲大蠊转录组测序样品处理流程图；图2：美洲大蠊断肢再生相关Wingless信号通路基因的表达热图；图3：Wg、Arr和Dsh基因dsRNA处理对美洲大蠊断肢再生的影响；图4：Wg、Arr和Dsh基因沉默效率检测。具体实施方式实施例1断肢再生相关Wingless信号通路基因的筛选1)RNA-Seq样品的制备对美洲大蠊进行挑选、截肢、收集腿部组织等操作，具体截肢手术处理的方法如下：对其中一侧的后肢转节和腿节结合处进行截肢，保留完整的基节和转节，将腿节、胫节和跗节一起剪掉(图1)，另一侧的腿全部保留用于对照试验，截肢处理方式的采用依据为专利技术人发现转节在断肢再生中起到非常重要的作用，当把转节剪掉时无法再生出具有正常形态和功能的新腿；在截肢后的不同时间点(1dpa、3dpa、5dpa、7dpa和10dpa(daypostamputation,dpa))收集样品(图1)；然后收集截肢侧的转节和基节末端作为实验组，取和实验组对称的组织作为对照组，分别命名为Pa.T1/3/5/7/10dpa和Pa.CK1/3/5/7/10dpa，每组试验含有三个生物学重复。对收集的组织进行总RNA提取，交于北京百迈客生物技术有限公司进行二代转录组测序(RNA-Seq)，选用的平台为IlluminaHiSeq。在完成Unigene功能注释(NR、Swissprot、GO、EggNOG、Pfam、KEGG)及基因结构分析(CDS预测；SSR分析)后，通过与未处理组进行比较，在mRNA水平进行基因表达量分析(基因表达定量和不同样品基因表达量总体分布分析)、差异表达基因筛选、差异表达基因聚类分析、差异表达基因的功能注释及富集分析(差异表达基因GO功能富集、差异表达基因EggNOG分类、差异表达基因KEGG注释、差异表达基因KEGG通路富集分析)和差异表达基因蛋白互作网络等，最终筛选得到若干与组织损伤修复及断肢再生相关的信号通路及基因，并统计出相关基因在不同修复再生时间节点的表达模式。基于美洲大蠊基因组数据库，采用生物信息学方法对美洲大蠊Wingless信号通路中的Wg、Arr和Dsh基因进行搜索，经过序列分析及比对后，获得美洲大蠊Wingless信号通路中的Wg、Arr和Dsh基因序列，其cDNA核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，全长分别为1194bp、5052bp和3180bp，分别编码398个氨基酸、1684个氨基酸和1060个氨基酸。实施例2靶向Wingless信号通路基因dsRNA的合成与获得1)Wg、Arr和Dsh基因dsRNA引物的设计基于本研究所得到Wg、Arr和Dsh基因的序列，采用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将靶向基因Wg、Ar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.美洲大蠊断肢再生相关基因，分别为Wg、Arr、Dsh三个基因，其中，Wg的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Arr的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，Dsh的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.美洲大蠊断肢再生相关基因，分别为Wg、Arr、Dsh三个基因，其中，Wg的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，Arr的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，Dsh的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。2.一组靶向沉默权利要求1所述的美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA，所述dsRNA有三个，分别靶向沉默Wg、Arr、Dsh三个基因，其中，靶向沉默Wg基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，靶向沉默Arr基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示，靶向沉默Dsh基因的dsRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。3.根据权利要求2所述的一组靶向沉默权利要求1所述的美洲大蠊断肢再生相关基因的dsRNA的制备方法，其特征在于，靶向沉默Wg基因的dsRNA通过以下方法制备：将SEQIDNo.4所示的基因片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Wg，然后以pTOPO-Wg为模板，以两端含有T7启动子的引物SEQIDNo.7和SEQIDNo.8，进行PCR扩增，PCR产物通过T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem转录合成；靶向沉默A...

【专利技术属性】
技术研发人员：任充华，李胜，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44