pH响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种制备蛋白质‑高分子两亲体的方法，该方法包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质‑引发剂结合体；(2)将所述蛋白质‑引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质‑高分子两亲体，所述高分子在pH5～10范围内具有pH响应性，所述高分子pKa在5‑10；该方法操作简单，化学结构明确，收率高，同时根据该方法制备得到的蛋白质‑高分子两亲体的蛋白活性高、pH响应性灵敏度高，可以作为化疗药物或诊断试剂的递送载体，提高小分子药物的靶向性，降低其副作用；同时蛋白质本身可以选择一些药用蛋白，借助pH响应性的高分子的靶向作用，可提高药用蛋白稳定性及其靶向性，有望极大拓展蛋白质药物在肿瘤诊疗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
pH响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用
本专利技术涉及生物医用材料领域，具体地，本专利技术涉及pH响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用。
技术介绍
蛋白自组装体已经作为一种重要的生物材料广泛应用于药物递送、肿瘤诊疗等领域。将蛋白质和疏水高分子连接在一起形成蛋白高分子两亲体，可以自组装成不同形貌的纳米颗粒。小分子药物和蛋白质药物都存在稳定性差、半衰期短和靶向性差的问题，制约了其在肿瘤诊疗中的应用。肿瘤组织中，活跃的糖酵解产生大量乳酸，相比较正常组织的弱碱性的胞外pH值，肿瘤的胞外pH呈酸性，约6.5。因此，利用肿瘤酸性微环境，研制具有pH响应性的药物递送系统尤为重要。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识做出的：小分子药物和蛋白质药物的稳定性差、半衰期短和靶向性差，制约了其应用，基于上述问题的发现，专利技术人开发了一种具有pH响应性的蛋白质-高分子两亲体及其制备方法，该制备方法操作简单，收率高，且该蛋白质-高分子两亲体具有靶向性，能对特定pH产生高敏反应。利用该蛋白质-高分子两亲体，一方面可以作为化疗药物或诊断试剂的递送载体，提高小分子药物的靶向性，降低其副作用；另一方面蛋白质本身可以选择一些药用蛋白，借助pH响应性的高分子的靶向作用，可提高药用蛋白稳定性及其靶向性，有望极大拓展蛋白质药物在肿瘤诊疗中的应用。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种制备蛋白质-高分子两亲体的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质-引发剂结合体；(2)将所述蛋白质-引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质-高分子两亲体，所述高分子在pH5～10范围内具有pH响应性，所述高分子pKa为5-10。需要说明的是，原位聚合可利用原子转移自由基聚合方法(ATRP)或者可逆加成断裂链转移聚合方法(RAFT)实现。根据本专利技术实施例的方法，整个聚合反应在水溶液中反应，有效避免了蛋白质与有机溶剂的接触，从而保证了蛋白质的活性。此外，专利技术人成功地将具有pH响应性的高分子与蛋白质结合，所形成的蛋白质-高分子两亲体具有了更加灵敏的pH响应性，在周围环境pH>两亲体pKa条件下以胶束形式存在，在周围环境pH<两亲体pKa条件下会解聚。根据本专利技术实施例的上述方法获得的蛋白质-高分子两亲体对于肿瘤微环境尤其敏感，肿瘤微环境的pH小于根据本专利技术实施例的蛋白质-高分子两亲体的pKa，因而，利用根据本专利技术实施例的上述方法获得的蛋白质-高分子两亲体具有靶向肿瘤而解体的功效，实现了蛋白质药物或其他可包载分子在肿瘤的定点释放。根据本专利技术实施例的方法操作简单，收率高，同时根据本专利技术实施例的方法制备得到的蛋白质-高分子两亲体具有pH高响应性，尤其是对于肿瘤微环境具有更加灵敏的响应，且获得的蛋白质-高分子两亲体的蛋白活性高、化学结构明确、入胞效果好、生物安全性高。根据本专利技术的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述引发剂包括原子转移自由基聚合反应的引发剂、可逆加成-断裂链转移聚合的链转移试剂。根据本专利技术的实施例，所述原子转移自由基聚合的引发剂包括选自多卤化物、卤代酯类、卤代酮类、卤代腈类的至少之一。根据本专利技术的实施例，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自硫代羰基硫基类和硫代膦基硫基类化合物。根据本专利技术的实施例，所述可逆加成-断裂链转移聚合的链转移试剂引发剂包括选自二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、黄原酸酯、三硫代碳酸酯的至少之一。根据本专利技术的实施例，所述蛋白质与所述引发剂经过共价键连接的，所述共价键连接的位点在所述蛋白质的N-或C-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点。进而所获得的蛋白质-引发剂结合体性质稳定，而不会破坏蛋白质的活性。根据本专利技术的实施例，所述蛋白质包括医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体，特别包括治疗性蛋白如胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子(TNF)和酶等。具体的例子包括，但不限于：天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)，骨形态发生蛋白(BMP)，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(CSF)、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽(VIP)、肠促胰酶肽(CCK)，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素(LHRH)、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂(IL-1RA)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶、巨噬细胞活化、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体等。根据本专利技术的具体实施例，所述蛋白质为人血清白蛋白。进而可采用一系列药用蛋白；根据本专利技术的实施例，所述连接位点为人血清白蛋白上的34位半胱氨酸。所述引发剂为式(I)所示化合物根据本专利技术的实施例，将预先溶于缓冲溶液中的所述蛋白质与所述引发剂在室温条件下反应5分钟-24小时。根据本专利技术的实施例，所述蛋白质与所述引发剂的偶联比是1:1。根据本专利技术的具体实施例，在HSA的34位半胱氨酸上修饰，人血清白蛋白只有一个游离的半胱氨酸，蛋白质与引发剂可以实现1：1的偶联比，进而实现定点修饰，保证了产品化学结构明确和产品均一性。根据本专利技术的具体实施例，所述原位聚合为原子转移自由基聚合反应。根据本专利技术的实施例，所述原位聚合是在低氧或者惰性气体氛围下、温度为0-80℃的条件下进行5分钟～24小时。进而聚合反应得到高分子分子量分布窄，聚合效率高。根据本专利技术的实施例，所述原位聚合包括原子转移自由基聚合和可逆加成-断裂链转移聚合。根据本专利技术的实施例，所述原子转移自由基聚合是在铜及配体的催化下进行的，所述铜是以CuCl、CuCl2、CuBr、CuBr2的形式提供的，所述配体为含氮类络合剂。根据本专利技术的实施例，所述配体为2,2-联吡啶、五甲基二乙烯三胺、三(2-二甲氨基乙基)胺或1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺。根据本专利技术的实施例，所述原位聚合是在CuCl以及1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的催化下进行的。进而原位结合的效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述CuCl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:(200-3000):(10-500):(10-4000)。进而原位聚合的效率进一步提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备蛋白质‑高分子两亲体的方法，其特征在于，包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质‑引发剂结合体；(2)将所述蛋白质‑引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质‑高分子两亲体，所述高分子在pH5～10范围内具有pH响应性，所述高分子pKa在5‑10。

【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白质-高分子两亲体的方法，其特征在于，包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质-引发剂结合体；(2)将所述蛋白质-引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质-高分子两亲体，所述高分子在pH5～10范围内具有pH响应性，所述高分子pKa在5-10。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发剂包括原子转移自由基聚合反应的引发剂、可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂；任选地，所述原子转移自由基聚合的引发剂包括选自多卤化物、卤代酯类、卤代酮类以及卤代腈类的至少之一；任选地，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自硫代羰基硫基类和硫代膦基硫基类化合物的至少之一；任选地，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、黄原酸酯、三硫代碳酸酯的至少之一；任选地，所述蛋白质与所述引发剂通过共价键连接，所述共价键连接的位点在所述蛋白质的N-或C-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点；任选地，所述蛋白质包括治疗性蛋白、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子或酶；任选地，所述蛋白质为人血清白蛋白；任选地，所述连接位点为人血清白蛋白上的34位半胱氨酸；优选地，所述引发剂为式(I)所示化合物任选地，将预先溶于缓冲溶液中的所述蛋白质与所述引发剂在室温条件下进行连接处理5分钟-24小时；任选地，所述蛋白质与所述引发剂的偶联比是1:1；任选地，所述原位聚合是在低氧或者惰性气体氛围下、温度为0-80℃的条件下进行5分钟～24小时；任选地，所述原位聚合包括原子转移自由基聚合和可逆加成-断裂链转移聚合；任选地，所述原子转移自由基聚合是在铜及配体的催化下进行的；任选地，所述铜是以CuCl、CuCl2、CuBr、CuBr2的形式提供的，所述配体为含氮类络合剂；任选地，所述配体为2,2-联吡啶、五甲基二乙烯三胺、三(2-二甲氨基乙基)胺或1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺；任选地，所述原子转移自由基聚合是在CuCl以及1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的催化下进行的；任选地，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述CuCl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:(200-3000):(10-500):(10-4000)；优选地，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述CuCl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三...

【专利技术属性】
技术研发人员：高卫平，李朋勇，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11