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选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体及其应用制造技术

技术编号:19476413 阅读:118 留言:0更新日期:2018-11-17 08:17
本发明专利技术公开了一种选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体及其应用。所述抗体的重链和轻链的可变区中的高变区(CDRs)和框架区的特定序列共同决定了其对KIT ITD的选择性,可选择性抑制胃肠道间质瘤中致癌性突变体KIT ITD。利用此抗体的可变区序列以及框架区序列,可制备人‑鼠融合抗体或者人源化抗体,在临床上用于治疗KIT ITD类型的胃肠道间质瘤。

【技术实现步骤摘要】
选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及单克隆抗体,特别涉及一种选择性抑制胃肠道间质瘤中致癌性突变体KITITD功能的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
c-kit基因编码的细胞表面受体KIT(被称为CD117),是第三类酪氨酸激酶家族的重要成员,在肥大细胞、正常造血干细胞等细胞中表达。作为单次跨膜蛋白,KIT胞内区为酪氨酸激酶区,胞外含5个Ig样的结构域(D1-D5);其中第五个Ig样的结构域及胞外近膜区,由外显子9编码。我们以及国际同行的研究发现,KIT受体的N-端三个Ig结构域与配体SCF(干细胞生长因子)结合后,受体发生二聚化,且近膜区的第四及第五个Ig样结构域会发生较大的构象改变,从而使受体胞内激酶区发生自磷酸化,继而激活下游信号通路。研究表明,在95%以上的胃肠道间质瘤(GIST)患者中可见c-kit的高表达或致癌性突变,因此,KIT是GIST的分子标志物,也是治疗GIST的药物靶标。2002年FDA批准的分子靶向药物伊马替尼,可抑制KIT受体的酪氨酸激酶活性,是治疗GIST的一线治疗药物。在GIST患者中,c-kit基因的致癌性突变主要发生在外显子9、11、13和17。其中,在外显子9的致癌性突变,绝大多数为第502-503位残基的内部串联重复突变(internaltandemduplication,ITD);该类突变发生于10~15%的GIST患者中。KITITD最早被Lux等人于2000年发现,北京大学肿瘤医院的沈琳和李健研究团队在我国的GIST患者中亦发现该类突变。KITITD特异性地发生于小肠,对伊马替尼表现出原发性的耐药性。有文章报道,相对于其他类型的GIST病人,KITITD病人在术后表现出更高的转移特性,预后效果也更差。在离体细胞实验中,已发现KITITD具有不依赖SCF的持续酪氨酸激酶活性,并对伊马替尼表现低敏感性;KITITD类GIST病人的肿瘤组织,可以外种移植到小鼠成瘤。这些临床观察和实验结果表明:KITITD突变体可以作为一类GIST患者分子分型的标记物,亦是驱动胃肠道间质瘤发生的重要分子。选择性地抑制KITITD功能的药理学工具,可望成为治疗该类胃肠道间质瘤的精准药物。KIT作为单次跨膜蛋白,人们试图发现针对其胞外区的、靶向治疗GIST等癌症的抗体类药物,这符合FDA批准单克隆抗体类抗癌药物逐年增多的趋势。KIT单抗的发现,早见于Broudy等人的工作,他们发现的SR-1单抗可以拮抗SCF与KIT的互作,削弱KIT信号转导,或降低GIST细胞表面KIT水平,或促进巨噬细胞对GIST的吞噬从而提高免疫细胞对GSIT细胞的清除效率。另外一种以KIT与SCF的结合区为抗原决定簇的抗体为人源化的CK6,由Lebron等人发现,它可以有效地抑制SCF介导的KIT自磷酸化以及下游的MAPK-AKT信号通路,从而在细胞或整体动物水平上抑制GIST的生长。由Reshetnyak等人发现的、识别KIT第四个结构域D4的抗体79D、KTN37和KNT0158,不仅可以有效抑制KIT稳转细胞的增殖,而且也可以抑制KITITD稳转细胞的增殖;Garton等人发现,KNT0158可以提高免疫检查点抗体(anti-CTLA-4和anti-PD-1)的抗肿瘤效果。由LeGall等人发现的、识别KITD5的抗体2D1和3G1可以通过诱导受体内化的机制,抑制稳定表达野生型KIT或者伊马替尼耐药的KITD816V突变体的白血病细胞增殖。但是,上述针对KIT的抗体,尚未进入临床研究,亦不能选择性识别KITITD突变体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体,以用于治疗KITITD类胃肠道间质瘤的药物制备。本专利技术用于开发个性化治疗胃肠道间质瘤药物的分子靶点是KITITD,其第502-505位氨基酸残基序列为AYAY,发生了内部串联重复突变。本专利技术通过采用杆状病毒/哺乳动物细胞表达制备了高纯度的KITITD抗原,运用传统的杂交瘤技术获得了可选择性识别胃肠道间质瘤中致癌性突变体KITITD的单克隆抗体,其中一株命名为3G2。本专利技术提供的可选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体是由存在于抗体重链和轻链可变区中的高变区(即互补决定区,CDRs)的特异性序列以及重链和轻链的框架区序列决定的。具体的,所述单克隆抗体的重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GYSITSDYA、YISYSGSTS、TRWRYRYTLAMDY;轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SSISY、YEIYK、QWNYPFT;其重链参与KITITD识别的框架区序列为YNPSLKS,轻链参与KITITD识别的框架区序列为GSGT。在本专利技术的一个实施例中,所获得的3G2抗体的重链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:1所示,轻链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:2所示。编码上述3G2抗体重链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:3所示,轻链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:4所示。本专利技术利用流式细胞术、表面等离子体技术证实所述单克隆抗体与野生型KIT以及KITITD的亲和力差异,并在离体细胞水平以及整体动物水平上评估了它们的有效性,证实其可以高效地选择性抑制KITITD介导的细胞增殖,说明KITITD可以作为胃肠道间质瘤个性化药物的靶标。在分子结构水平上,证实3G2抗体的重链和轻链的CDR区以及框架区共同识别KITITD。KITITD的氨基酸残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422、Gln427、Val429、Pro467、Gln475、Lys383、Thr385、Gln414、Ile415、Leu416、Pro467、Pro468、Lys471、Ala502、Tyr503、Tyr505和Asn507构成单克隆抗体识别的表位。在开发治疗GIST的精准药物中具有关键作用。本专利技术的有益效果:1.本专利技术制备了可选择识别KITITD的单克隆抗体。采用杆状病毒-哺乳动物细胞表达技术,克隆、表达并纯化了含有KITITD的第四至第五结构域的蛋白;利用杂交瘤技术,制备了近50株单克隆抗体,并通过ELISA方法筛选出可选择性识别KITITD的单克隆抗体。2.本专利技术证实所述单克隆抗体可以选择性识别KITITD。本专利技术用电转法分别构建了稳定表达KITWT及KITITD的Ba/F3细胞系,利用免疫印迹及流式技术进一步证实了稳定细胞系构建成功;利用流式细胞术证实了所述单抗可差异性地识别稳定表达KITWT及KITITD的Ba/F3细胞系。3.本专利技术证实所述单克隆抗体能有效地抑制KITITD细胞的增殖。首先,我们评估了所述单抗对离体的、稳定表达KITITD的Ba/F3细胞增殖的抑制能力,其中3G2抗体的IC50为1.29±0.11nM。其次,我们将Ba/F3KITITD稳转细胞系通过皮下接种至免疫缺陷裸鼠成瘤,发现3G2抗体在2mg/kg、4mg/kg两个浓度下都可以有效地抑制肿瘤的生长。综上,本专利技术构建的KITITDBa/F3细本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GYSITSDYA、YISYSGSTS、TRWRYRYTLAMDY;轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SSISY、YEIYK、QWNYPFT;其重链参与KIT ITD识别的框架区序列为YNPSLKS,轻链参与KIT ITD识别的框架区序列为GSGT。

【技术特征摘要】
1.一种选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GYSITSDYA、YISYSGSTS、TRWRYRYTLAMDY;轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SSISY、YEIYK、QWNYPFT;其重链参与KITITD识别的框架区序列为YNPSLKS,轻链参与KITITD识别的框架区序列为GSGT。2.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:1所示,轻链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:2所示。3.一种抗体基因,编码权利要求1或2所述的选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体。4.如权利要求3所述的抗体基因,其特征在于,所述抗体基因编码重链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:3所示,轻链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQIDSEQNo:4所示。5.权利要求1或2所述的选择性识别致癌性突变体KITITD的单克隆抗体在制备治疗KITITD类胃肠道间质瘤的药物中的应用。6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述KITITD类胃肠道间质瘤中存在致癌性突变体KITITD,其第502-505位氨基酸残基序列为AYAY。7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述KITITD的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘合力丁焕弟刘建梅梁文君徐飞林兆晗李志强
申请(专利权)人:北京大学
类型:发明
国别省市:北京,11

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