一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备、应用制造技术

本发明专利技术属于比色探针技术领域，具体涉及一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备和应用。该可逆比色探针结构式如下所示：

【技术实现步骤摘要】
一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备、应用
本专利技术属于比色探针
，具体涉及一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备和应用。
技术介绍
葡萄糖是细胞代谢的主要碳源和能量来源，在细胞的自然生长过程中起着至关重要的作用，血液中的葡萄糖水平与糖尿病或低血糖等疾病密切相关。而在过去的几十年里，糖尿病已经成为最大的公共健康威胁之一。因此，监测血糖含量对于预防和治疗糖尿病或其他相关疾病具有重要意义。目前，人们已经报道了许多葡萄糖检测方法，比如荧光传感方法、比色传感方法、化学发光传感方法和高效液相色谱法等。在这些分析方法中，比色法引起了人们的广泛关注，除了准确、易操作、低成本等特点，比色法还可以通过肉眼观察颜色变化来分析待测物，这样需要更少的劳力，甚至不需要检测设备。但是目前的比色探针大都是一次性消耗品，具有循环可重复利用能力的葡萄糖可逆比色探针还没有，不利于可持续发展。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备和应用，该可逆比色探针可以实现重复使用。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针，结构式如下所示：。基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针的制备方法，步骤如下：1）取原料孔雀石绿和亚硫酸氢盐；2）将孔雀石绿和亚硫酸氢盐加入磷酸盐缓冲液（浓度10mmol/LPBS）中，混合后孔雀石绿浓度为20µM，亚硫酸氢盐的浓度为25µM，室温下反应3min，得到基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针溶液。所述孔雀石绿与亚硫酸氢根的物质的量比为1：（1-1.25）。所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾或亚硫酸氢铵。可逆比色探针在检测样品中葡萄糖方面的应用。具体应用时，先将待测样品与葡萄糖氧化酶混合孵育（孵育在37℃下进行30min）得到反应溶液，然后将反应溶液加入可逆比色探针溶液中，然后分别测试反应后的颜色和紫外可见光谱变化。实验发现：随着待测样品中葡萄糖含量的增多，将反应溶液加入可逆比色探针溶液中后逐渐从无色变成蓝色，紫外可见光谱的变化为：618nm处的吸光度随着葡萄糖含量的增多而增大。本专利技术以孔雀石绿与亚硫酸氢根发生1,4-加成反应得到的加成产物为比色探针，研究发现，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下能够产生双氧水H2O2，而H2O2能够氧化孔雀石绿与亚硫酸氢根的加成反应产物使该产物重新变回蓝色的孔雀石绿，如果将待测样品与葡萄糖氧化酶混合孵育后的反应溶液加入探针溶液中探针溶液由无色变为蓝色，说明加成反应产物变回孔雀石绿，此时表明反应溶液中含有葡萄糖经葡萄糖氧化酶催化后的H2O2，进一步说明待测样品中含有葡萄糖，如此就可以根据H2O2引起的从无色到蓝色的颜色变化或者相对应的紫外可见吸收光谱变化来间接检测葡萄糖。本专利技术的比色探针在检测过葡萄糖之后，还可继续向探针溶液中加入充分的亚硫酸氢根，将探针反应后的产物孔雀石绿重新变回孔雀石绿与亚硫酸氢根的加成产物，从而实现探针的多次重复使用。本专利技术具有以下有益效果：1）本专利技术所采用的原料孔雀石绿、亚硫酸氢盐廉价易得，成本不高；2）本专利技术的可逆比色探针在制备时方法简便，能够便捷地检测溶液和人血清中的葡萄糖，选择性好、灵敏度高、最低检测限为70nM；3）本专利技术中探针在检测过葡萄糖后，还可以通过加入亚硫酸氢根反应后继续再次检测葡萄糖，这个过程中只消耗了微量的、非常便宜的亚硫酸氢盐，大大降低了成本；4）本专利技术比色探针灵敏度高、选择性好、简单便捷，而且可以重复使用，有望在生物医学领域推广使用。附图说明图1是孔雀石绿的高分辨质谱图。图2是孔雀石绿和亚硫酸氢根反应后的高分辨质谱图。图3是孔雀石绿和亚硫酸氢根反应后，继续加入过氧化氢反应后的高分辨质谱图。图4是探针溶液中加入不同浓度葡萄糖（0-1000µM）与葡萄糖氧化酶的反应溶液后的紫外可见光谱图和颜色变化照片（1.5mL最终混合溶液中含有葡萄糖的浓度为0-1000µM）。图5是618nm处的相对吸光度（A/A0）与葡萄糖浓度的线性关系图，其中A和A0分别代表存在不同浓度葡萄糖和不存在葡萄糖时含有探针的PBS缓冲体系在618nm处的吸光度。图6是血清中潜在干扰物与葡萄糖共存时含有探针的PBS缓冲体系的相对吸光度，插图从左到右分别对应横坐标从左到右的干扰物质与葡萄糖共存时的体系颜色照片。图7是含有探针溶液的PBS缓冲体系及其加入其他糖类干扰物质（半乳糖、蔗糖、麦芽糖）和葡萄糖后的相对吸光度，插图从左到右分别对应不含糖和含半乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖时体系颜色照片（1.5mL最终混合溶液中半乳糖、蔗糖、麦芽糖的浓度均为1200µM，葡萄糖的浓度为120µM）。图8是探针的可逆循环能力考察结果图，插图对应可逆循环实验样品的颜色变化图。图9是实施例1孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的1HNMR图谱。具体实施方式下面结合实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1：在1.5mL的离心管中加入300μL50mM的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH6.8），继续加入150μL200μM的孔雀石绿和30μL1.25mM的亚硫酸氢钠形成混合液，用超纯水将总体积补充为1.5mL，混合液中含10mM磷酸盐缓冲溶液、20μM孔雀石绿和25μMNaHSO3，混合液反应3分钟即可得到含有（下称加成产物）的探针溶液（下称溶液B）。HRMS（ESI）：[M+H]+（孔雀石绿C23H25N2+）calcd329.2012,found329.2018;[M-H]+（孔雀石绿与亚硫酸氢根反应得到的探针C23H26N2+O3S）calcd409.1664,found409.1595；[M+H]+（探针被过氧化氢氧化重新得到的孔雀石绿C23H25N2+）calcd329.2012,found329.2017。1、探针的可逆反应机理探讨通过孔雀石绿加入HSO3−以及接着添加H2O2后发生的高分辨质谱变化验证了探针的可逆反应机理。如图1所示，测得孔雀石绿的质谱数据为329.2018，对应孔雀石绿的分子量329.2012。孔雀石绿加入HSO3−完全反应后，质谱图上出现负离子峰质谱数据409.1595（图2），这与预期加成反应形成的加成产物的分子量410.1664（409.1664）相吻合；加成产物加入H2O2并充分反应后测得质谱数据329.2017（图3），与孔雀石绿的分子量相一致，进一步说明加成产物被H2O2重新氧化成孔雀石绿。因此，通过上述实验结果和分析，结合紫外可见吸收光谱数据，能够确定孔雀石绿与HSO3−和H2O2发生了还原氧化可逆反应，即HSO3−与孔雀石绿的C=C双键发生亲核加成反应生成加成产物，并且加成产物能被H2O2氧化成原来的孔雀石绿。这些结果表明探针即孔雀石绿与HSO3−的加成产物在与H2O2发生反应后，还能通过加入HSO3−继续与H2O2反应。2、探针溶液的颜色和紫外可见光谱随加入的葡萄糖浓度的变化首先使40μLPBS缓冲溶液（50mM，pH6.8）、20μL葡萄糖氧化酶（10mg/mL）和140μL不同浓度（0、1.07、5.36、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针，其特征在于，结构式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针，其特征在于，结构式如下所示：。2.权利要求1所述的基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：1）取原料孔雀石绿和亚硫酸氢盐；2）将孔雀石绿和亚硫酸氢盐加入磷酸盐缓冲液中，室温下反应3min，得到基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针溶液。3.如权利要求2所述的可逆比色探针的制备方法，其特征在于，所述孔雀石绿与亚硫酸氢根的物质的量比为1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝辉，孙远强，屈凌波，杨冉，孟红敏，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41