一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒，包括以下步骤:分别提取待测样品的基因组DNA；设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。本发明专利技术简便易行，检测快速高效，该检测方法所用检测时间仅需1小时左右，而PCR扩增时间较长，大大提高了检测的效率；灵敏度高：该方法的检测下限为5×10

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒。
技术介绍
环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等专利技术的一种恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在Bst大片段聚合物的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。SYBRGreenⅠ是一种荧光染料，根据反应液中成分的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增产物)时为橙色，阳性(有扩增产物)时为绿色。LAMP的方法优势是在恒温条件下进行，不需要PCR仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，适于苗期杂草的快速诊断及检测。日本看麦娘(AlopecurusjaponicusSteud.)与看麦娘(AlopecurusaequalisSobol.)都属于禾本科看麦娘属，是我国范围内普遍存在的冬季作物田优势杂草，其生活史与作物(如小麦和油菜)相似，可使这些作物产量和质量显著下降。农田杂草防治宜早不宜迟，这是由于大龄杂草对除草剂的代谢能力远高于苗期杂草，且如果防治失败，杂草得以繁殖下一代，农田土壤种子库中该种杂草的数量将逐渐增加。这个结果将导致来年杂草防除难度加大，同时也会提高抗药性杂草突变株产生的概率。由于同一属内形态学差异较小，对于日本看麦娘与看麦娘的区别往往是到了抽穗开花期才能鉴别，在苗期一般很难区分。因此，农民在杂草防治时往往将这两种杂草归为一类，甚至有时将菵草也与其归为一类，导致用药不当，防除效果不佳。近年来，抗性日本看麦娘已在国内多个省市如江苏、安徽均有发现，且在不同地区日本看麦娘的抗性程度也有差异。因此，在苗期及时区别日本看麦娘、看麦娘不仅有助于指导农民正确用药，也可以降低日本看麦娘的抗性发生水平，减少除草剂用药量。但经检索，目前国内外尚未对苗期日本看麦娘的LAMP快速分子检测有相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对麦田恶性杂草日本看麦娘、看麦娘苗期难以鉴定，从而导致用药选择不当(尤其是在抗药性发生的种群中)、草害防治效果不佳的现象，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏高的检测方法。根据日本看麦娘的保守基因序列(ITS)，优化反应条件，能对苗期的日本看麦娘进行检测，可以及时发现田间优势种是否是日本看麦娘，从而指导正确田间用药，及时控制苗期的草害，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。本专利技术提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，包括以下步骤:(1)、分别提取待测样品的基因组DNA；(2)、设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；(3)、在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；(4)、根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。优选的是，所述步骤(2)中特异性引物为在日本看麦娘的保守基因ITS上设计的1对外引物和1对内引物。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中的两对引物分别是：外引物：F3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’B3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’内引物：FIP:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’BIP:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中LAMP恒温扩增反应体系：上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为60℃--66℃。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为60℃。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为66℃。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为62℃。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应条件为63℃60min，80℃10min。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)荧光染料为SYBRGreenⅠ。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中鉴定是否为日本看麦娘通过LAMP扩增产物颜色和电泳图谱条带进行判断。上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中LAMP扩增产物显示绿色，和/或，电泳图谱为梯状条带时，判定为日本看麦娘；若LAMP扩增产物为橙色，和/或，电泳图谱无条带扩增，判定为看麦娘。一种用于快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的检测试剂盒，包含如下反应体系：上述任一方案优选的是，所述试剂盒内的两对特异性引物为，F3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’B3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’FIP:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’BIP:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’上述任一方案优选的是，试剂盒内反应体系包括BstDNA聚合酶(8U/μL)(4-16U)、Mg2+(100mM)浓度(1-3μL)、引物FIP/BIP(20μM)及F3/B3(10μM)浓度(0.5-4μL)、甜菜碱(8M)浓度(2-8μL)。上述任一方案优选的是，试剂盒反应体系包括BstDNA聚合酶(8U/μL)1μL，10×ThermoPolBuffer2.5μL，100mMMgSO42μL，10mMdNTP2μL，20uMFIP1μL，20uMBIP1μL，10uMF31.5μL，10uMB31.5μL，8M甜菜碱4μL，盒反应体系加入无菌超纯水制备，100次包装，低温运输，-20℃保存，有效期1年。本专利技术提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，本专利技术针对麦田恶性杂草日本看麦娘、看麦娘苗期难以鉴定，从而导致用药选择不当(尤其是在抗药性发生的种群中)、草害防治效果不佳的现象，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏高的检测方法。根据日本看麦娘的保守基因序列(ITS)，优化反应条件，能对苗期的日本看麦娘进行检测，可以及时发现田间优势种是否是日本看麦娘，从而指导正确田间用药，及时控制苗期的草害，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。本专利技术提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，植物条形码研究发现，核糖体核DNA候选条形码ITS在被子植物中的通用性较高且具有最高的物种分辨率。为了能够及时鉴别日本看麦娘、看麦娘，控制田间杂草种群的蔓延及指导田间农民正确用药，设计了以日本看麦娘ITS序列为模板，以LAMP技术为基础的分子生物学检测方法快速检测苗期的日本看麦娘，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高检测效率。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术提供的分子检测方法能够快速检测苗期日本看麦娘、看麦娘并进行区分，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本专利技术的有益结果是；(1)简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物验收变化即可判定结果，不需要昂贵的仪器设备以及繁琐的电泳过程；(2)检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)、分别提取待测样品的基因组DNA；(2)、设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；(3)、在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；(4)、根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)、分别提取待测样品的基因组DNA；(2)、设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；(3)、在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；(4)、根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。2.如权利要求1所述的一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中特异性引物为在日本看麦娘的保守基因ITS上设计的1对外引物和1对内引物。3.如权利要求1或2所述的一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的两对引物分别是：F3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’B3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’FIP:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’BIP:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’。4.如权利要求1所述的一种快速鉴定苗期...

【专利技术属性】
技术研发人员：周凤艳，张勇，沈艳，姚传春，刘小林，高同春，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34