一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针及其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针，所述探针无需化学标记即可实现对microRNA(miRNA)的生物发光检测，该探针为一种单体蛋白质，包括以下三个部分：1)可特异性识别DNA‑miRNA杂合链的转录激活子样效应因子结构域；2)具有生物发光功能的萤光素酶结构域；3)上述两个结构域的连接区。该探针利用偶联在磁珠表面的单链DNA与待测miRNA进行杂交，并通过由转录激活子样效应因子和萤光素酶结构域构成的生物发光探针对杂交产生的DNA‑miRNA杂合链进行特异性识别，最终实现miRNA的高灵敏度检测。具有成本低廉、结果直观、使用便捷的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针及其构建方法及应用
本专利技术涉及一种基于转录激活子样效应因子的microRNA生物发光检测技术，属于生物医学分析领域。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一种重要的生物标志物，其在人体内的非正常表达和转移与肿瘤等重大疾病的发生和发展具有密切关系。因此，miRNA的高灵敏度检测方法在疾病的早期诊断、发病机理的研究和相关药物研发等领域都具有广阔的市场前景。近年来，生物发光技术凭借其灵敏度高、特异性好的优点，已在miRNA检测中得到了一定的应用。该技术以萤光素酶催化底物发光作为检测信号，无需外部光源激发，因此可有效避免传统荧光检测法中存在的生物自荧光干扰、光漂白、光毒性等弊端。然而，目前的生物发光检测技术必须通过萤光素酶的化学标记才能实现miRNA分子的特异性识别和检测。上述化学标记过程不仅操作繁琐、价格昂贵，而且容易造成萤光素酶稳定性和光学性能的下降。因此，建立一种简便、直观、成本低廉、无需对萤光素酶进行化学标记的miRNA生物发光检测技术十分必要。
技术实现思路
为克服现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于转录激活子样效应因子的microRNA生物发光检测探针，该探针利用偶联在磁珠表面的单链DNA与待测miRNA进行杂交，并通过由转录激活子样效应因子和萤光素酶结构域构成的生物发光探针对杂交产生的DNA-miRNA杂合链进行特异性识别，最终实现miRNA的高灵敏度检测。具有成本低廉、结果直观、使用便捷的特点。实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针，所述探针无需化学标记即可实现对miRNA的生物发光检测，该探针为一种单体蛋白质，包括以下三个部分：1)可特异性识别DNA-miRNA杂合链的转录激活子样效应因子结构域；2)具有生物发光功能的萤光素酶结构域；3)上述两个结构域的连接区。上述基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针的构建方法，包括以下步骤：(1)探针各功能元件编码片段的设计与合成：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段、四种识别不同碱基的串联结构域编码片段、以及萤光素酶结构域编码序列，所述转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述识别不同碱基的四种串联结构域的编码序列分别如SEQIDNO.2～SEQIDNO.5所示；所述萤光素酶结构域编码序列如SEQIDNO.6所示；(2)构建骨架载体：通过引物P1和P2扩增转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段；通过引物P3和P4扩增萤光素酶的编码片段；将上述扩增产物混合作为模板，并通过引物P1和P4扩增融合编码片段；将上述融合片段插入pET-26b(+)载体；所述融合编码片段的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述引物P1～P4的核苷酸序列如SEQIDNO.8～SEQIDNO.11所示；(3)串联结构域编码片段文库的构建：通过引物P5～P20对四种串联结构域的编码序列进行扩增，扩增产物作为串联结构域编码片段文库保存，所述引物P5～P20的核苷酸序列如SEQIDNO.12～SEQIDNO.27所示；(4)探针完整表达载体的构建：根据待检测miRNA序列，从步骤3)制备的文库中挑选相应串联结构域编码片段，通过Golden-Gate技术进行拼接和克隆；所述Golden-Gate技术中使用核苷酸序列如SEQIDNO.28和SEQIDNO.29所示的P21和P22引物；(5)探针的表达与纯化：通过大肠杆菌BL21(DE3)菌株对上述完整表达载体进行表达，并通过镍亲和层析纯化，即制得所述生物发光检测探针。本专利技术还提供了利用上述生物发光检测探针检测miRNA的方法，包括以下步骤：(1)单链DNA偶联磁珠的制备：根据待检测miRNA的序列设计互补的生物素化单链DNA，并将其偶联至链霉亲和素修饰的磁珠表面，所得磁珠用牛血清白蛋白封闭过夜；(2)miRNA的检测：将步骤(1)制备的磁珠与待测miRNA、以及生物发光探针共同于室温下孵育30min，利用磁力架分离和洗涤磁珠后，向溶液中添加萤光素酶底物缓冲液，即可得到检测结果；所得检测结果通过光谱仪进行分析，或通过智能手机作为便携设备直接读取。步骤(1)的具体方法为：将10μM生物素化的单链DNA与1mg表面修饰有链霉亲和素的磁珠孵育4h；利用磁力架分离上述磁珠，用200μL的1×TALEbuffer洗涤磁珠3次，用100μL的牛血清白蛋白重悬磁珠，并置于4℃冰箱过夜；上述经牛血清白蛋白封闭的磁珠用磁力架分离，并用100μL的1×TALEbuffer重悬，保存于4℃冰箱中待用；所述生物素化的单链DNA与待检测microRNA互补，且末端标记有生物素；所述修饰有链霉亲和素的磁珠的粒径为1μM。步骤(2)中通过光谱仪进行分析时，检测条件为：关闭光源，发射狭缝宽度为20nm，检测波长范围为400nm至600nm。步骤(2)中通过智能手机进行读取时，将磁珠转入白色不透明96孔板中，然后向每个孔中加入等体积的萤光素酶底物缓冲液，最后将96孔板置于暗室中用智能手机直接拍摄结果。与现有技术相比本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术提供的技术方案无需对萤光素酶进行繁琐、昂贵的化学标记即可实现miRNA的高灵敏度检测；(2)检测过程无需离心操作，仅通过磁力架即可完成检测工作，因此具有便捷、快速的特点；(3)检测信号可通过智能手机直接读取，因此本专利技术很适合应用于医疗资源匮乏的地区。附图说明图1为本专利技术提供的生物发光检测探针的检测原理示意图；图2为本专利技术提供的生物发光检测探针的结构示意图；图3为本专利技术实施例中制备的生物发光探针的电泳结果图；图4为本专利技术实施例中制备的生物发光探针与DNA-miR-21杂合链结合的凝胶迁移结果示意图；图5为本专利技术实施例中制备的生物发光探针的生物发光光谱示意图；图6为本专利技术实施例中制备的生物发光探针的对不同浓度miR-21的响应关系结果示意图；图7为本专利技术实施例中基于智能手机检测生物发光检测信号对不同浓度miR-21的响应关系结果示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细具体的说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。实施例1：本实施例中以miR-21序列作为待检测对象，检测原理如图1所示。本实施例中首先构建由转录激活子样效应因子和萤光素酶结构域构成的生物发光探针，方法如下：(1)探针各功能元件编码片段的设计与合成：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段、四种识别不同碱基的串联结构域编码片段、以及萤光素酶结构域编码序列；通过全基因合成技术制备上述编码片段，并插入pUC57质粒载体。(2)探针各功能元件编码片段的扩增与融合：通过引物P1和P2扩增转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段，并在扩增产物的两端分别添加NdeI酶切位点和连接区编码序列；通过引物P3和P4扩增萤光素酶的编码片段，并在扩增产物的两端分别添加连接区编码序列和SalI酶切位点；将上述扩增产物按照等摩尔比混合作为模板，并通过引物P1和P4扩增出融合片段，该融合编码片段的核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针，其特征在于：所述探针无需化学标记即可实现对miRNA的生物发光检测，该探针为一种单体蛋白质，包括以下三个部分：1)可特异性识别DNA‑miRNA杂合链的转录激活子样效应因子结构域；2)具有生物发光功能的萤光素酶结构域；3)上述两个结构域的连接区。

【技术特征摘要】
1.一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针，其特征在于：所述探针无需化学标记即可实现对miRNA的生物发光检测，该探针为一种单体蛋白质，包括以下三个部分：1)可特异性识别DNA-miRNA杂合链的转录激活子样效应因子结构域；2)具有生物发光功能的萤光素酶结构域；3)上述两个结构域的连接区。2.一种权利要求1所述的基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)探针各功能元件编码片段的设计与合成：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段、四种识别不同碱基的串联结构域编码片段、以及萤光素酶结构域编码序列，所述转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述识别不同碱基的四种串联结构域的编码序列分别如SEQIDNO.2～SEQIDNO.5所示；所述萤光素酶结构域编码序列如SEQIDNO.6所示；(2)构建骨架载体：通过引物P1和P2扩增转录激活子样效应因子的N-端和C-端结构域编码片段；通过引物P3和P4扩增萤光素酶的编码片段；将上述扩增产物混合作为模板，并通过引物P1和P4扩增融合编码片段；将上述融合片段插入pET-26b(+)载体；所述融合编码片段的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述引物P1～P4的核苷酸序列如SEQIDNO.8～SEQIDNO.11所示；(3)串联结构域编码片段文库的构建：通过引物P5～P20对四种串联结构域的编码序列进行扩增，扩增产物作为串联结构域编码片段文库保存，所述引物P5～P20的核苷酸序列如SEQIDNO.12～SEQIDNO.27所示；(4)探针完整表达载体的构建：根据待检测miRNA序列，从步骤3)制备的文库中挑选相应串联结构域编码片段，通过Golden-Gate技术进行拼接和克隆；所述Golden-Gate技术中使用核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，吴云华，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42