一种用于DNA甲基化检测的试剂盒与方法及应用技术

技术编号:19448333 阅读:281 留言:0更新日期:2018-11-14 17:15
本发明专利技术公开了一种用于DNA甲基化检测的试剂盒,其至少包括生物素标记的甲基化的λ‑DNA和链霉素包被的磁珠。还公开了该试剂盒在少量DNA样品甲基化检测中的应用,样品量可低至1ng。本发明专利技术还公开了一种DNA甲基化检测的方法及其应用。本发明专利技术提供的技术方案显著降低了DNA甲基化检测所需的最低起始样品量,且不需要特定的试剂盒和实验设备,节省成本,具有较高的普适性。在富集甲基化DNA的同时不引入外源DNA污染,若采取文库构建和高通量测序的检测方法时不会受到外源DNA信息的影响,有利于进一步降低测序成本,提高数据质量。

【技术实现步骤摘要】
一种用于DNA甲基化检测的试剂盒与方法及应用
本专利技术涉及分子生物学
,具体涉及DNA甲基化检测领域,更具体地,涉及一种用于DNA甲基化检测的试剂盒与方法及应用。
技术介绍
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,主要发生在DNA的CpG岛,参与基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程。对DNA甲基化的检测广泛应用于干细胞研究、疾病诊断治疗等多个领域。DNA甲基化检测方法按原理主要可分为三类:重亚硫酸盐转化、甲基化敏感的限制性酶切法、抗体富集甲基化位点法。传统的DNA甲基化检测方法需要微克级别的起始样品量,但是随着稀有细胞群体(如胚胎细胞)、液体活检(包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA)、细胞间异质性等逐渐成为研究的热点,开发并完善对少量样品进行DNA甲基化检测的技术变得尤为重要。目前现有的研究少量样品甲基化的方法主要有以下几种。一种方法是少量样品的全基因组重亚硫酸氢盐测序法(WGBS)(Wangetal.,NatProtoc,2013),利用带有单个甲基化接头的Tn5转座子将DNA片段化,之后通过退火添加第二个甲基化的接头,同时修复缺口,使链的5’和3’端都有接头。之后通过重亚硫酸氢盐处理,将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,PCR扩增后转变为胸腺嘧啶,测序后与未经处理的序列比较,判断CpG位点是否发生甲基化。该方法将样品DNA需求量降低至20ng。缺点是对整个基因组进行检测,测序成本高昂,只适合对少量样品进行分析。另一种方法使用对甲基化敏感的限制性内切酶对样品进行处理后再进行重亚硫酸盐转化的方法进行少量样品DNA甲基化研究(Guetal.,Nat.Methods,2010),即简并代表重亚硫酸盐测序法(RRBS)。使用甲基化敏感限制酶MspI消化掉未甲基化的DNA片段,再补加50ng片段化的去磷酸化大肠杆菌K12基因组DNA补足重亚硫酸盐转化反应体系,能够对30ng的起始DNA样品进行DNA甲基化图谱分析。这种方法相比于WGBS方法降低了成本,但不足之处在于只能对甲基化敏感限制酶识别位点进行检测,而限制酶识别位点是有限的,因此不能用于进行全基因组水平的甲基化研究,且补加外源DNA易对测序结果产生影响。还有一种方法,是利用甲基化DNA免疫共沉淀技术(MeDIP)对少量样品进行DNA甲基化检测(TaiwoOetal.,NatProtoc,2012),通过补加λDNA后利用DiagenodeAuto-MeDIP试剂盒以及SX-8GIP-Star全自动样品处理系统对50ng的DNA样品进行了MeDIP甲基化分析。这种方法可以对少量样品全基因组的甲基化水平进行检测,但需要利用试剂盒和全自动样品处理系统进行MeDIP实验,成本依然较高,不具有普遍适用性。不除去补加的外源DNA可能对测序结果产生影响。现有三种技术的缺点分别是:1、测序成本高昂,只适合对少量样品进行分析。2、虽然降低了成本,但不能用于进行全基因组水平的甲基化研究,体系中的外源DNA可能对测序结果产生影响。3、能对全基因组的甲基化水平进行检测,但需要利用试剂盒和全自动样品处理系统进行实验,不具有普遍适用性。补加外源DNA易对测序结果产生影响。此外,以上三种DNA甲基化检测技术所需的最低样品起始量为20-50ngDNA,仍不适用于少量来源样品的甲基化分析。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷,本专利技术要解决的技术问题是:1、降低起始样品量,以对更少量来源的样品进行DNA甲基化分析;2、在进行全基因组水平DNA甲基化检测的基础上,不依靠特定的商业化试剂盒和大型实验设备,减少测序规模和降低实验成本。本专利技术的技术方案如下:本专利技术在第一方面提供了一种用于DNA甲基化检测的试剂盒,该试剂盒至少包括生物素标记的甲基化的λ-DNA和链霉素包被的磁珠。在一个较优实施例中,上述试剂盒还包括生物素标记的未甲基化的λ-DNA。本专利技术在第二方面提供了上述试剂盒在少量DNA样品甲基化检测中的应用,少量DNA样品的样品量可低至1ng。本专利技术在第三方面提供了一种DNA甲基化检测的方法,包括以下步骤:步骤1、制备生物素标记的λ-DNA;步骤2、将部分步骤1中制备得到的生物素标记的λ-DNA进行甲基化处理;步骤3、将生物素标记的未甲基化的λ-DNA和生物素标记的甲基化的λ-DNA按比例加入到片段化的DNA样品中,进行甲基化DNA的富集处理;步骤4、用链霉素包被的磁珠除去生物素标记的λ-DNA,纯化得到甲基化的DNA样品;步骤5、对所述甲基化的DNA样品进行甲基化水平检测。优选地,上述步骤1中,通过PCR扩增制备生物素标记的λ-DNA,上游引物为:ACAACCGAAGAATGCGACAC(SEQNo.1),下游引物为:TCCTGAGACAATACAGCACGAC(SEQNo.2),扩增得到的片段长度约为300bp。优选地,上述步骤3中,生物素标记的未甲基化的λ-DNA和生物素标记的甲基化的λ-DNA的质量比为2:1。优选地,上述步骤3中,甲基化DNA的富集处理采用甲基化免疫共沉淀、甲基化DNA亲和捕获或甲基化DNA结合域方法进行。更优选地,上述步骤3中,甲基化DNA的富集处理采用甲基化免疫共沉淀方法进行。优选地,上述步骤5中,甲基化水平检测采用PCR、qPCR或高通量测序方法进行。本专利技术在第四方面提供了上述方法在少量DNA样品甲基化检测中的应用,少量DNA样品的样品量可低至1ng。与现有技术相比,本专利技术提供的技术方案在MeDIP技术的基础上,设计并采用了生物素标记的片段,提高了抗原抗体的结合效率并减少了操作中样品的损耗,实现了对少量甲基化DNA的富集和检测,其具有以下显著优点:1、与少量样品WGBS的DNA甲基化检测方法相比,本专利技术建立在MeDIP技术上,即利用抗原抗体亲和富集甲基化DNA片段后再进行甲基化检测,方法的优点在于只将甲基化的DNA区域进行富集并检测,测序规模小成本低,精度和性价比高,更加适合大量临床样本之间的比较研究,而且所需的起始样品量降低为1ngDNA,更加适用于少量来源样品的甲基化分析。2、与使用RRBS方法进行少量样品的DNA甲基化检测技术相比,本专利技术的技术在同样低成本的基础上可以实现对全基因组DNA甲基化的水平进行精确检测。3、与现有使用MeDIP进行少量样品DNA甲基化检测的方法相比,本专利技术的技术所需最低起始样品量更低,且不需要特定的试剂盒和实验设备,节省成本,具有较高的普适性。富集甲基化DNA的同时不引入外源DNA污染,如果采取文库构建和高通量测序的检测方法时不会受到外源DNA信息的影响,有利于进一步降低测序成本,提高数据质量。应理解,在本专利技术范围内中,本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。所以凡是不脱离本专利技术所公开的原理下完成的等效或修改,都落入本专利技术保护的范围。以下将结合附图对本专利技术作进一步说明,以充分说明本专利技术的目的、技术特征和技术效果。附图说明图1示出了本专利技术较优实施例的实验流程图;图2示出了本专利技术较优实施例中基于末端具有生物素修饰的引物PCR扩增得到的300bpBio-λ-DNA的琼脂糖凝胶电泳图;图3本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于DNA甲基化检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒至少包括生物素标记的甲基化的λ‑DNA和链霉素包被的磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种用于DNA甲基化检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒至少包括生物素标记的甲基化的λ-DNA和链霉素包被的磁珠。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括生物素标记的未甲基化的λ-DNA。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在少量DNA样品甲基化检测中的应用,其特征在于,所述少量DNA样品的样品量低至1ng。4.一种DNA甲基化检测的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:步骤1、制备生物素标记的λ-DNA;步骤2、将部分步骤1中制备得到的所述生物素标记的λ-DNA进行甲基化处理;步骤3、将生物素标记的未甲基化的λ-DNA和生物素标记的甲基化的λ-DNA按比例加入到片段化的DNA样品中,进行甲基化DNA的富集处理;步骤4、用链霉素包被的磁珠除去生物素标记的λ-DNA,纯化得到甲基化的DNA样品;步骤5、对所述甲基化的DNA样品进行甲基化水平检测。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤1中,通过...

【专利技术属性】
技术研发人员:康亚妮赵小东邵志峰毛湛睿金戈旋
申请(专利权)人:上海交通大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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