一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒技术

技术编号:19448331 阅读:69 留言:0更新日期:2018-11-14 17:15
本发明专利技术公开了一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒,属于生物检测领域。该检测方法为将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到缓冲液中,加入待测液后,所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下,扩增得到端粒酶重复片段;该端粒酶重复片段与核酸分子探针杂交,形成双链DNA;该双链DNA吸附带正电的聚集诱导发光化合物,使带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号,根据荧光强度得到端粒酶的活性。所述核酸分子探针的序列如SEQ ID No:4所示。检测端粒酶的试剂盒包含该探针分子。本发明专利技术所用探针无修饰,聚集诱导发光化合物信号灵敏度高,实际应用性强。

【技术实现步骤摘要】
一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒
本专利技术属于生物检测领域,具体涉及一种端粒酶的检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒。
技术介绍
人类端粒酶是一种核糖核蛋白,它能够通过自身的RNA模板在端粒的尾端合成重复的TTAGGG片段。在正常细胞中,通过每一次的复制循环,端粒将逐渐变短,从而导致细胞衰老和死亡。相反地,在绝大多数种类的癌症细胞中,端粒的长度能够因为端粒酶的上调和激活而维持不变,这使得癌症细胞能够进行无限的分裂和增殖。同时,一些转移性癌组织也会有端粒酶活性上调的现象。因此,端粒酶被认为是一种有效的肿瘤标志物,对端粒酶活性的检测以及抑制将对癌症的早期检测,诊断以及治疗发挥着重要的作用。基于端粒酶的重要意义,目前也已经发展了多种荧光检测方法,这些方法能得到很好的准确度和灵敏度等,但往往也需要设计和合成带修饰的荧光核酸分子探针,这给检测工作带来了一定的成本和负担。因此,设计一种无修饰的核酸分子探针用于端粒酶的检测具有重要的研究意义。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中端粒酶检测过程中核酸分子探针结构复杂、合成成本高以及制作困难的技术问题。根据本专利技术的一个方面,提供了一种端粒酶的检测方法,包含以下步骤:(1)将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到pH为6~8的缓冲液中,形成反应液;所述核酸分子探针为含有至少一个CCCTAA单链序列的DNA;(2)将待测液加入到步骤(1)所述的反应液中,形成反应体系;该反应体系在30℃-60℃条件下充分反应;所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下,以dNTPs为原料,扩增得到端粒酶重复片段;所述端粒酶重复片段为含有至少一个TTAGGG序列的单链DNA;所述端粒酶重复片段与步骤(1)所述核酸分子探针杂交,形成双链DNA;该双链DNA吸附步骤(1)所述的带正电的聚集诱导发光化合物,使所述带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号;检测反应体系的荧光强度,根据荧光强度得到所述待测提取液中端粒酶的活性。优选地,所述带正电的聚集诱导发光化合物的结构式如式Ⅰ所示:优选地,步骤(1)所述核酸分子探针为茎环结构,所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列;优选地,所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。优选地,所述端粒酶引物片段的序列如SEQIDNo:1所示;所述核酸分子探针的序列如SEQIDNo:2所示。优选地,步骤(1)所述带正电的聚集诱导发光化合物在步骤(2)所述反应体系中的浓度为20μM-80μM;步骤(1)所述核酸分子探针在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.5μM-1μM;步骤(1)所述端粒酶引物片段在步骤(2)所述反应体系中的浓度为1μM-5μM;步骤(1)所述氧化石墨烯在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.03mg/ml-0.06mg/ml。优选地,步骤(2)所述反应的时间为30min-60min;步骤(2)所述检测反应体系的荧光强度的激发波长为340nm~380nm,发射波长为400nm~600nm。按照本专利技术的另一方面,提供了一种核酸探针分子,所述核酸分子探针为茎环结构,所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列;优选地,所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。按照本专利技术的另一方面,提供了一种检测端粒酶的试剂盒,该试剂盒包含权利要求8所述的核酸探针分子。优选地,该试剂盒还包括带正电的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs和RNase抑制剂。本专利技术与现有技术相比,具有如下有益效果:(1)本专利技术反应体系中核酸分子探针和端粒酶引物片段由于共轭效应能够吸附在氧化石墨烯表面,少量带正电荷的聚集诱导发光化合物结合在带负电荷的DNA分子骨架上,聚集发出的荧光信号被纳米材料氧化石墨烯通过能量转移过程淬灭掉,因此背景荧光信号弱。将端粒酶加入到上述体系后,端粒酶引物片段能够扩增重复片段(TTAGGG)n,该重复片段能够与核酸分子探针杂交,形成梳状的双链DNA结构,该双链DNA结构脱离氧化石墨烯表面,且能够吸附大量的聚集诱导发光化合物,从而发出强烈的荧光信号,最终达到对端粒酶的高效检测。(2)本专利技术引入带正电荷的AIE分子以及氧化石墨烯,设计无修饰的核酸分子探针,通过正电荷的AIE分子与负电荷的DNA骨架之间的静电结合作用以及氧化石墨烯吸附单链排斥双链和淬灭荧光的性质,即可完成荧光信号的强变化过程。整个过程不需要复杂的实验操作,灵敏度高,实际应用性强。(3)本专利技术中核酸分子探针序列设计巧妙,茎环结构的核酸分子探针,能被延伸的端粒酶片段打开,形成梳状的双链结构;该探针无修饰,减少了大量的有机合成工作。(4)专利技术利用聚集诱导发光(AIE)分子作为荧光信号分子,利用纳米材料氧化石墨烯(GO)降低荧光背景信号,从而实现了仅仅利用无标记的核酸分子探针(MB),完成了对端粒酶的高效检测。(5)本专利技术选用的带正电的聚集诱导发光化合物Silole-R是一种典型的AIE分子,它拥有两个正电荷,具有很好的水溶性。这些分子在溶液状态发出很弱的荧光信号,但是在聚集的状态下,却能够发出较强的荧光信号。与荧光分子相比,光稳定性较好,聚集诱导发光化合物聚集发光,光能不会损失,使检测结果稳定。附图说明图1为检测端粒酶的原理图。图2为分别向体系中加入裂解液、热灭活的端粒酶、经过端粒酶抑制剂处理的端粒酶以及有活性的端粒酶后体系的荧光变化曲线。图3为不同个数子宫颈癌细胞(Hela细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。图4为不同个数人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。图5为不同个数人膀胱癌细胞(E-J细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。图6为正常人尿液以及癌症病人清尿和血尿中的细胞提取端粒酶用于该体系后的检测结果统计图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术,并不用于限定本专利技术。此外,下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本专利技术的基本原理为:利用带正电荷的聚集诱导发光分子作为荧光信号分子,纳米材料氧化石墨烯作为荧光淬灭基团,以及茎环结构的无标记核酸分子探针,完成对端粒酶的高效检测。反应开始前,体系中的端粒酶引物片段以及拥有部分单链的核酸分子探针吸附在氧化石墨烯表面,其吸附的带正电荷的聚集诱导发光分子发出的荧光信号被氧化石墨烯淬灭掉,因此背景信号低。加入有活性的端粒酶后,其引物片段能够扩增重复片段(TTAGGG)n,该重复片段能够与核酸分子探针杂交,形成梳状的双链DNA结构,该双链DNA结构脱离氧化石墨烯表面,且能够吸附大量的带正电荷的聚集诱导发光分子,从而发出强烈的荧光信号,最终达到对端粒酶活性的高效检测。实施例1以检测Hela细胞中端粒酶的提取物,以及将提取物处理后作对照实验来进一步说明本专利技术。图1为检测端粒酶的原理图。步骤一:细胞中端粒酶的提取。取出培养状态良好的贴壁细胞,弃去其培养基,待PBS缓冲液洗净后,用胰蛋白酶进行消化,收集1×106本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种端粒酶的检测方法,其特征在于,包含以下步骤:(1)将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到pH为6~8的缓冲液中,形成反应液;所述核酸分子探针为含有至少一个CCCTAA单链序列的DNA;(2)将待测液加入到步骤(1)所述的反应液中,形成反应体系;该反应体系在30℃‑60℃条件下充分反应;所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下,以dNTPs为原料,扩增得到端粒酶重复片段;所述端粒酶重复片段为含有至少一个TTAGGG序列的单链DNA;所述端粒酶重复片段与步骤(1)所述核酸分子探针杂交,形成双链DNA;该双链DNA吸附步骤(1)所述的带正电的聚集诱导发光化合物,使所述带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号;检测反应体系的荧光强度,根据荧光强度得到所述待测提取液中端粒酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种端粒酶的检测方法,其特征在于,包含以下步骤:(1)将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到pH为6~8的缓冲液中,形成反应液;所述核酸分子探针为含有至少一个CCCTAA单链序列的DNA;(2)将待测液加入到步骤(1)所述的反应液中,形成反应体系;该反应体系在30℃-60℃条件下充分反应;所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下,以dNTPs为原料,扩增得到端粒酶重复片段;所述端粒酶重复片段为含有至少一个TTAGGG序列的单链DNA;所述端粒酶重复片段与步骤(1)所述核酸分子探针杂交,形成双链DNA;该双链DNA吸附步骤(1)所述的带正电的聚集诱导发光化合物,使所述带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号;检测反应体系的荧光强度,根据荧光强度得到所述待测提取液中端粒酶的活性。2.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法,其特征在于,所述带正电的聚集诱导发光化合物的结构式如式Ⅰ所示:3.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法,其特征在于,步骤(1)所述核酸分子探针为茎环结构,所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列;优选地,所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。4.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法,其特征在于,所述端粒酶引物片段的序列如SEQIDNo:1所示;...

【专利技术属性】
技术研发人员:欧小文夏帆娄筱叮
申请(专利权)人:华中科技大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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