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一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用技术

技术编号:19448323 阅读:39 留言:0更新日期:2018-11-14 17:14
本发明专利技术提出了一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用,以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞,采用紫杉醇模拟体内化疗过程,逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株,测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5‑FU等食管癌常用化疗药物的耐药指数,选出敏感药物5‑FU及顺铂进一步联合诱导建立获得性人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC,测定该细胞株的干细胞标志表达明显增高及转移迁移特性增强。本发明专利技术采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法,可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制,筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用
本专利技术涉及耐药细胞株领域,特别是指一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用。
技术介绍
食管癌是最常见的致命性恶性肿瘤之一,在我国的发病及死亡例数占世界一半以上。食管癌早期诊断困难,发现时常进展到中晚期。手术、化疗、放疗是治疗癌症的标准流程。手术后进行化疗可以有效地杀伤残余的肿瘤细胞,但是肿瘤细胞会对化疗药物产生多药耐药性,耐药细胞具有更强的转移性,肿瘤的远处转移是肿瘤治疗失败,造成肿瘤病人死亡的主要原因。因此克服、防止或逆转肿瘤细胞的多药耐药性对于提高化疗效果十分重要。而建立肿瘤多药耐药细胞株对于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制,筛选可性的耐药逆转剂及寻找耐药肿瘤细胞的治疗靶点具有重要的应用价值。食管癌的化疗是治疗过程中的一个重要手段,食管癌的化疗药物治疗目前还停留在细胞毒药物化疗上,包括紫杉醇(PTX)、顺铂(CDDP)、5-氟尿嘧啶等。紫杉醇是新型抗微管药物,通过促进微管蛋白聚合抑制解聚,保持微管蛋白稳定,抑制细胞有丝分裂。顺铂属细胞周期非特异性药物,可抑制癌细胞的DNA复制过程,并损伤其细胞膜上结构,有较强的广谱抗癌作用。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成,对RNA的合成也有一定抑制作用。阿霉素属周期非特异性药物,可抑制RNA和DNA的合成,对RNA的抑制作用最强,抗瘤谱较广,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。目前实验室所获得耐药细胞多为一种化疗药物筛选而来,而临床上肿瘤患者化疗时常常为多种化疗药物联合应用,或者一种化疗方案产生耐药时更换化疗方案再进行新一轮的化疗,肿瘤细胞经历了多种化疗药物,长时间的作用后,细胞生物学特征与经历一种化疗药物作用的肿瘤细胞相比发生了很大的改变,实验室尚未见和临床化疗经过相似的耐药细胞系。
技术实现思路
本专利技术提出人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用,解决体外筛选抗肿瘤药尚未有耐紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的细胞株的技术问题。本专利技术的技术方案是这样实现的:本专利技术提供了一种人食管癌多药耐药细胞株的构建方法如下:(1).将人食管癌细胞EC9706加入含10%血清的1640培养液进行培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代;(2).当细胞生长至密度达到80%时,更换新鲜的培养液,并在细胞培养液中加入紫杉醇,使得紫杉醇的作用浓度为2.5μg/ml,继续培养24小时,大部分细胞会死亡,弃去含紫杉醇的细胞培养液,换用新鲜的培养基;(3).待耐药细胞增殖后传代,将获得的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法,重复培养3次,得到在紫杉醇作用浓度为2.5μg/ml时,能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(4).将步骤(2)中紫杉醇的作用浓度逐步增至5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml,再将步骤(3)得到的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法,重复3次,得到在紫杉醇作用浓度为5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml,能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(5).将步骤(4)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性,发现该细胞对紫杉醇和阿霉素产生中高度耐药性,对5-FU仍保持高度敏感性;(6).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇,在细胞培养液中加入5-FU,使得5-FU的作用浓度为5μg/ml,继续培养24小时,大部分细胞会死亡,换用新鲜的培养基继续培养;(7).待耐药细胞增殖后传代,将获得的细胞依次按照步骤(6)的方法,重复培养3次,得到在5-FU作用浓度为5μg/ml时,能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(8).将步骤(6)中5-FU作用浓度逐步增至10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml,再将步骤(7)得到的细胞依次按照步骤(6)的方法,重复3次,得到在紫杉醇作用浓度为10μg/ml,5-FU作用浓度为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml时能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(9).将步骤(8)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性;该细胞对紫杉醇、阿霉素及5-FU产生中高度耐药性,对顺铂和长春新碱产生低度耐药性;(10).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇和15μg/ml的5-FU,并在细胞培养液中加入顺铂,使得顺铂的作用浓度为1μg/ml,继续培养24小时,大部分细胞会死亡,换用新鲜的培养基继续培养;(11).待耐药细胞增殖后传代,将获得的细胞依次按照步骤(10)的方法,重复培养3次,得到在顺铂作用浓度为1μg/ml时,能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(12).将步骤(10)中顺铂的作用浓度逐步增至2μg/ml、3μg/ml及4μg/ml,再将步骤(11)得到的细胞依次按照步骤(10)的方法,重复3次,得到在紫杉醇和5-FU维持浓度下,顺铂为4μg/ml作用浓度下,能稳定生长、传代、复苏的活细胞;(13).将步骤(12)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药性;该细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂产生高度耐药性,对5-FU和长春新碱产生中度耐药性;(14).将步骤(12)得到的细胞同时加入紫杉醇、顺铂及5-FU,使其作用浓度分别为10μg/ml、4μg/ml及25μg/ml,24h后更换新鲜的不含药物培养基,继续培养,重复(14)步骤3次,撤去药物培养1个月,适时换液,复测对对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药指数不变,表明该细胞株的耐药性稳定,历时39个月获得人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC。本专利技术的有益效果在于:一、本专利技术通过细胞形态学观察、MTT法测定耐药指数、细胞周期的测定、荧光定量PCR及Transwell小室实验,评价人食管癌多药耐药细胞株的生物学特性,成功建立EC9706/PDFC耐药株。本专利技术还提供了人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在筛选抗肿瘤药物中的应用,以及人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在制备抗肿瘤药物中的应用。二、本专利技术的建立人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的方法更贴近临床肿瘤患者应用化疗药物治疗的过程,虽费时很长,但所获得的耐药细胞对多种化疗药物具有中高度耐药性,更接近于多种化疗药治疗后仍产生耐药的细胞的生物学特性,更具有研究价值;本专利技术可用于分析人食管癌多药耐药后的形态学及生物学特征的变化;研究肿瘤对多种化疗药耐药后的分子机制;筛选具有可靠性的耐药逆转剂;寻找耐药肿瘤细胞的治疗靶点中的应用,具有较高的科研和生产应用价值。三、本专利技术采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法,接近于临床上化疗的方式,可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制,筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。附图说明图1为倒置相差显微镜下亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本专利技术的人食管癌多药耐药细胞株活细胞观察图。图2亲本细胞人食管癌细胞EC9706(A)和本专利技术的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC(B)的细胞周期分析图。图3为Transwell小室实验比较亲本细胞人食管癌细胞本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法,其特征在于:以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞,采用紫杉醇模拟体内化疗过程,逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株,用MTT法测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5‑FU食管癌常用化疗药物的耐药指数,选出耐敏感药物5‑FU、顺铂的细胞株,通过模拟体内化疗进一步诱导建立人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC。

【技术特征摘要】
1.一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法,其特征在于:以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞,采用紫杉醇模拟体内化疗过程,逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株,用MTT法测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU食管癌常用化疗药物的耐药指数,选出耐敏感药物5-FU、顺铂的细胞株,通过模拟体内化疗进一步诱导建立人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC。2.如权利要求1所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法,其特征在于,所述采用紫杉醇模拟体内化疗过程,逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株的具体步骤为:(1)将人食管癌EC9706细胞加入含有10%血清的1640培养液进行培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代,当细胞生长至密度达到80%时,更换新鲜的培养液,并在细胞培养液中加入紫杉醇,使得紫杉醇的作用浓度为2.5µg/ml,继续培养24小时后,弃去含紫杉醇的细胞培养液,得初级耐紫杉醇人食管癌EC9706细胞;(2)将步骤(1)得到的初级耐药人食管癌EC9706细胞重复步骤(1)的培养3次,得紫杉醇的作用浓度为2.5µg/ml时的中级耐紫杉醇人食管癌EC9706细胞;(3)将步骤(1)中紫杉醇的作用浓度逐步增至5µg/ml、7.5µg/ml、10µg/ml,然后将步骤(2)得到的中级耐药人食管癌EC9706细胞,重复不同紫杉醇浓度条件下的步骤(1)的培养步骤,分别重复3次,得到在紫杉醇作用浓度为5µg/ml、7.5µg/ml、10µg/ml条件下的耐紫杉醇细胞株。3.如权利要求1所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法,其特征在于,所述选出耐敏感药物5-FU的细胞株的步骤为...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘瑞敏齐义军王明丽晁玮霞孙丹妮
申请(专利权)人:河南大学
类型:发明
国别省市:河南,41

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