一种生产类胡萝卜素的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物离心，弃上清，收集菌体，然后添加丙酮，进行超声破壁，再静置30min，然后离心，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入KOH甲醇溶液，静置10‑30min，再添加NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。本发明专利技术制备获得的类胡萝卜素产品纯度较高，达到94%以上，折算成收率达到90%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种生产类胡萝卜素的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产类胡萝卜素的方法。
技术介绍
类胡萝卜素是一类脂溶性色素，大多难溶于水，可溶于有机溶剂，呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，因其分布广泛、结构多样及功能较多而成为一种重要的天然色素。它同时存在于植物、动物和微生物中。类胡萝卜素因其结构特性而具有多种生物功效，研究表明，类胡萝卜素可能具有防治心脏病、癌症、白内障和几种人体慢性疾病的作用和其他生物活性作用。此外，类胡萝卜素作为一种优良的食品添加剂和改善人类营养的营养增补剂，它的优良品质和效果，很久以来就被世界各国所公认，被誉为最有希望的抗氧化剂。类胡萝卜素由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来备受人们青睐。化学合成的胡萝卜素较难被人体所吸收，生理活性较低，而且会合成对人体有害的中间产物，不易分离，具有一定的毒副作用，没有被大规模推广使用。天然存在胡萝卜素没有毒副作用，越来越受到人们的重视。目前，天然类胡萝卜素的来源主要是从植物中提取和微生物发酵提取。植物提取是指从胡萝卜等富含类胡萝卜素的植物中提取类胡萝卜素。微生物发酵提取是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵生产类胡萝卜素。中国专利技术专利CN102702777A公开了一种酶法水解从植物原料中提取类胡萝卜素的方法，首先将新鲜植物原料和水用匀浆机匀浆，用超声波破碎机破碎；再加入纤维素酶、果胶酶和表面活性剂进行酶解，然后在酶解液中加入硅藻土，过滤后将滤液真空干燥，即得到类胡萝卜素；该方法消耗原材料多，成本高，受原料影响较大等缺点。由于从天然植物中提取类胡萝卜素工艺复杂并且产率较低，受原料影响较大，因此通过微生物发酵法生产类胡萝卜素已成为研究热点。例如中国专利CN104805168A公开了采用光合细菌发酵生产类胡萝卜素的方法，通过调节培养条件至微氧，类胡萝卜素产量明显提高。也有部分研究对混合菌株发酵进行了研究，例如“混菌固态发酵山药皮产类胡萝卜素的工艺研究，食品工业科技2014年”，采用粗壮脉纹孢菌和植物乳杆菌混合固态发酵生产类胡萝卜素，固态发酵时间为60小时，产率不足200ug/g培养物，产率相对较低。受植物来源的类胡萝卜素含量的限制，当前天然胡萝卜素的价格较高，是化学品的两倍，成本相对较高，而微生物发酵法存在产量低，培养成本高的缺陷，申请人前期的专利技术“一种复合微生物培养物及其在生产类胡萝卜素中的应用”提供了一种成本低廉的微生物方法，该方法产率高，在该技术的基础上，申请人继续对类胡萝卜素产品进行了分离提取。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术类胡萝卜素生产存在的等缺陷，提供了一种生产类胡萝卜素的方法。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物离心，弃上清，收集菌体，然后添加丙酮，进行超声破壁，再静置30min，然后离心，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入KOH甲醇溶液，静置10-30min，再添加NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。具体地，所述方法包括如下步骤：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，收集菌体，然后按照1kg菌体：1-1.5L丙酮的量添加丙酮，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为30min，再静置30min，然后5000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理15min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后5000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入五分之一体积的质量分数为30％的KOH甲醇溶液，静置10-30min，再添加5%的NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。具体地，复合微生物培养物包括枯草芽孢杆菌、荚膜红假单胞菌以及粘红酵母菌。进一步地，所述复合微生物培养物按照如下步骤制备而得：步骤1）首先将水稻秸秆粉碎至1-5cm，然后进行蒸汽爆破预处理；步骤2）将经过蒸汽爆破处理的水稻秸秆过50目筛，收集筛下物，然后与酒糟按照3：1的质量比混合得到混合物，再添加到占混合物2-3倍重量的水中，加热至60-70℃，保温条件下100rpm搅拌60-90min，然后加热至121℃，保温3-5min，自然冷却至室温，得到培养液；步骤3）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-7％的接种量接入含有培养液的光合培养发酵罐中进行培养，培养时间为24-36h，然后接种荚膜红假单胞菌种子液和粘红酵母菌种子液，接种量均为8-10％；继续培养24-36h，制得复合微生物培养物。优选地，所述蒸汽爆破预处理的条件为：压力1.5-1.8MPa、停留时间5-10min。优选地，所述培养条件为：温度为30℃，溶氧浓度为1-3mg/L，光照强度为2000-3000lux。优选地，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行培养，得到枯草芽孢杆菌种子液。优选地，所述荚膜红假单胞菌种子液的制备方法为：荚膜红假单胞菌划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养，然后挑取菌落，接种到液体种子培养基中进行种子培养，得到荚膜红假单胞菌种子液。优选地，所述液体种子培养基组分为：葡萄糖3g/L、酵母膏2g/L、氯化铵0.5g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L。优选地，所述粘红酵母菌种子液的制备方法为：将粘红酵母菌接种到YPDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到粘红酵母菌种子液。本专利技术实施例具体采用的菌株为枯草芽孢杆菌ATCC6633、荚膜红假单胞菌ATCC33762、粘红酵母菌ATCC32759。所述菌株的种子液制备方式并不限于实施例记载的方式，还可以根据本领域的常规制备方式来完成。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：本专利技术制备获得的类胡萝卜素产品纯度较高，达到94%以上，折算成收率达到90%以上。本专利技术提取工艺中，采用超声辅助破壁提取，减少了提取试剂的使用量；蒸汽爆破预处理使半纤维素和木质素部分降解，且破坏了木质素与半纤维素对纤维素的包裹作用，使纤维素的结晶区受到破坏，原料的孔隙率和内表面积增大，因而更有利于后续纤维素的酶水解作用进行。本专利技术对农业废弃物秸秆进行了粉碎和爆破处理，结合酒糟，可以为枯草芽孢杆菌提供正常的生长条件，原料相对低廉，能够降低企业成本；适当的营养缺乏或低氧条件胁迫条件下可以使得菌体细胞内产生更多的类胡萝卜素等物质，然后也容易造成菌株增殖缓慢，工业生产中，需要平衡类胡萝卜素产量、菌体增殖以及培养成本；荚膜红假单胞菌和粘红酵母菌是产类胡萝卜素的菌株，二者可以共生，能够利用木糖作为发酵底物，但是秸秆处理物中的木糖等还原糖养料不足，不利于菌株生长；本专利技术首先采用枯草芽孢杆菌对秸秆和酒糟进行发酵处理，枯草芽孢杆菌可以产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物离心，弃上清，收集菌体，然后添加丙酮，进行超声破壁，再静置30min，然后离心，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入KOH甲醇溶液，静置10‑30min，再添加NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。

【技术特征摘要】
1.一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物离心，弃上清，收集菌体，然后添加丙酮，进行超声破壁，再静置30min，然后离心，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入KOH甲醇溶液，静置10-30min，再添加NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，收集菌体，然后按照1kg菌体：1-1.5L丙酮的量添加丙酮，超声破壁，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为30min，再静置30min，然后5000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理15min，超声功率为300W，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后5000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入五分之一体积的质量分数为30％的KOH甲醇溶液，静置10-30min，再添加5%的NaCl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，复合微生物培养物包括枯草芽孢杆菌、荚膜红假单胞菌以及粘红酵母菌。4.根据权利要求3所述的复合微生物培养物，其特征在于，所述复合微生物培养物按照如下步骤制备而得：步骤1）首先将水稻秸秆粉碎至1-5cm，然后进行蒸汽爆破预处理；步骤2）将经过蒸汽爆破处理的水稻秸秆过50目筛，收集筛下物，然后与酒糟按照3：1的质量比混合得到混合物，再添加到占混...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉刚，钟银珊，应建航，应佳丽，
申请(专利权)人：杭州园泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33