一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途制造技术

本发明专利技术提供一种生产睾丸酮专用的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌，所述工程菌为将睾丸酮乙酸酯水解酶基因通过表达载体转入宿主菌中或插入到宿主菌的染色体上，获得可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。本发明专利技术还提供一种生产睾丸酮的方法。与现有技术相比，本发明专利技术的方法反应条件温和，并且在合成过程中，合成路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。产率可高达98％以上，能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上有用的化合物‑睾丸酮。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种工程菌以及使用该工程菌制备睾丸酮的用途。
技术介绍
甾体激素(Steroidhormone)，又称类固醇激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，有极高的医药价值。在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(Estrone，1932年)、雌二醇(Estradiol，1932年)、睾丸酮(Testosterone，1935年)及皮质酮(Corticosterone，1939年)等的纯品结晶，之后又阐明了其化学结构，从此开创了甾体化学及甾体药物的新领域。随后，人们为扩大生产规模，降低成本，又以薯蓣皂苷(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使其成为医院临床使用不可缺少的药物。微生物可以选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构，这是通过微生物产生的酶催化进行的。1952年，美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化，生成11α-羟基孕酮，科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种，可以使一定结构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性，一般能使底物分子上1个或2个基团起反应。至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应，如氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常，一个酶促反应可以代替几个化学反应步骤，这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。睾丸酮(Testosterone)可简称睾酮(17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮)，结构式如式I所示，其是人体体内的基本激素，具有重要的药用价值。它能够加强肌肉的合成代谢，从而增加肌肉含量。此外，睾酮促进身体加速生产血红细胞，提升血液的给肌肉的供氧能力，达到加强肌肉力量及爆发力的效果。目前有两种常用的睾丸酮制备方法：一是以薯蓣皂苷为原料经过十二步反应得到睾丸酮；二是以4AD(△1,4-二烯雄甾酮-3,17-二酮)为原料，经过四步反应得到睾丸酮。上述两种方法均为化学方法，具有环境污染大，反应复杂等缺点。目前国内外也开始了对微生物转化制备睾丸酮的研究，但仍收效甚微。因此，当前对用于生产高纯度的睾丸酮的方法仍存在需求。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人发现，使用可以表达睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物，可以选择性地改造睾丸酮乙酸酯的结构。甾体化合物的微生物转化作用是利用微生物的酶对甾体底物进行特定的化学反应，基于此，本专利技术的专利技术人发现了一种使用睾丸酮乙酸酯为底物生产睾丸酮的方法。本专利技术的方法不仅能得到较高纯度的睾丸酮，而且进一步简化了生产工艺，并降低了生产成本。本专利技术的目的是通过以下的方案实现的。一方面，本专利技术提供了一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物。优选地，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。优选地，所述微生物包含编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽的核苷酸序列；更优选地，所述核苷酸序列具有或者为选自以下的核苷酸序列：1)编码由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；2)与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；优选地为与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；3)在严格条件下，与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。进一步优选地，所述核苷酸序列具有或者为编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；进一步优选地，所述核苷酸序列具有或者为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。另一方面，本专利技术提供一种用于生产睾丸酮的工程菌，所述工程菌具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因；优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌；优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)；优选地，所述工程菌的质粒载体选自pET26b(+)或pET28a(+)；优选地，所述基因编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽；进一步优选地，所述基因具有或者为选自以下的核苷酸序列：1)编码由SEQIDNO:2所述的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；2)与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；更优选地为具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；3)在严格条件下，与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；优选地，所述基因具有或者为编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；优选地，所述基因具有或者为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。优选地，所述工程菌为将具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中或将具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因插入到宿主菌的染色体上，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。更优选地，所述工程菌为通过将睾丸酮乙酸酯水解酶基因经过NdeI和HindIII双酶切处理后，插入到所述pET26b(+)的NdeI和HindIII酶切位点之间得到的重组表达载体转入所述大肠杆菌中，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。优选地，所述睾丸酮乙酸酯水解酶基因是以分枝杆菌MycobacteriumneoaurumDSM44074基因组DNA为模板，分别以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为引物，进行PCR扩增得到的。再一方面，本专利技术提供一种生产睾丸酮的方法，所述方法包括以下步骤：1)将上述具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物或工程菌发酵至对数期，然后对其进行诱导表达；2)以睾丸酮乙酸酯为底物，使用步骤1)得到的微生物或工程菌进行催化反应，得到睾丸酮。优选地，在步骤1)中，诱导表达的诱导试剂为IPTG；更优选地，所述IPTG的终浓度为0.5-2mM，进一步优选地为1mM；优选地，在步骤1)中，所述诱导表达的培养温度为15-37℃，更优选为22℃；优选地，在步骤1)中，所述诱导表达的培养时间为12-36h，更优选为24小时；优选地，在步骤1)中，所述发酵的培养温度为30-37℃，更优选为37℃；优选地，在步骤1)中，所述发酵的培养时间为12-15d，更优选为13d；优选地，在步骤2)中，所述催化反应的温度为20-37℃，更优选为25℃；优选地，在步骤2)中，所述微生物或工程菌以完整细胞菌悬液、无细胞裂解液或者固定化细胞的形式进行催化反应；所述固定化细胞优选为固定化微球。优选地，所述方法还包括将得到的睾丸酮进行分离纯化；更优选地，所述分离纯化是将反应得到睾丸酮的溶液用2倍体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩结晶、过滤干燥得到睾丸酮。与现有技术相比，本专利技术具有以下的优点：1)本专利技术使用睾丸酮乙酸酯作为底物，通过一步生物催本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物。

【技术特征摘要】
1.一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物。2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述微生物包含编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列具有或者为选自以下的核苷酸序列：1)编码由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；2)与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；优选地为与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；3)在严格条件下，与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述核苷酸序列具有或者为编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列具有或者为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。5.一种用于生产睾丸酮的工程菌，所述工程菌具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因；优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌；更优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)；优选地，所述工程菌的质粒载体选自pET26b(+)或pET28a(+)；优选地，所述基因编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽；进一步优选地，所述基因具有或者为选自以下的核苷酸序列：1)编码由SEQIDNO:2所述的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；2)与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；更优选地为具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；3)在严格条件下，与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；优选地，所述基因具有或者为编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：常尊学，张鑫，隋靓，邹雷，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21