一种鳖类血红蛋白肽制造技术

本发明专利技术公开了一种鳖类血红蛋白肽，其制备方法包括血红细胞提取、血红蛋白制备、酶解、脱色、分离，具体为：新鲜鳖类血中加入柠檬酸三钠抗凝，离心后弃去上清液，清洗后离心得血红细胞；将血红细胞冻融后超声破壁得血红蛋白溶液；向血红蛋白溶液中加入复合蛋白酶，再加入磷酸二氢钾和乙二胺四乙酸二钠，进行酶解，酶解结束后灭酶，过滤，滤液即为酶解液；向酶解液中加入活性炭脱色，调节pH至中性，超滤，截留液再纳滤，纳滤液冷冻干燥，即得血红蛋白肽。有益效果为：本发明专利技术血红蛋白肽纯度高、脱色效果好、活性高，可以快速杀灭细菌，并有广谱的抗菌特性，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

【技术实现步骤摘要】
一种鳖类血红蛋白肽
本专利技术涉及生物活性成分
，特别涉及一种鳖类血红蛋白肽。
技术介绍
自从抗生素被发现后，由于它具有良好的抑菌效果被广泛地应用于医疗、传统兽药和饲料添加剂中，但是也由于抗生素的过度使用，致病菌的耐药性和药物残留等问题越来越严重，逐渐引起了人们的重视，寻找抗生素的有效替代品，解决耐药性及药物残留问题，迫在眉睫。而抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）是一种原核生物及真核生物均能产生的、分布广泛且种类繁多的、具有广谱抗菌活性的多肽类物质，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物、癌细胞、病毒等均有明显的抑制作用，被视为具有极大应用前景的抗生素替代品，成为了国内外的研究热点。抗菌肽最早是瑞典科学家Boman等在一种名叫惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）的昆虫体内诱导并分离纯化得到的，并将其命名为天蚕素（Cecropins）。到目前为止，人们纷纷从各种原核及真核生物当中鉴定出并分离得到1700多种抗菌肽类物质。抗菌肽的种类繁多，分布也十分广泛，随着对抗菌肽的研究深入，抗菌肽的类别也越来越清晰。目前，抗菌肽一般根据以下几个方面进行分类：根据抗菌肽的合成途径将抗菌肽分为非核糖体合成抗菌肽（non-ribosomallysynthesizedpeptides）和核糖体合成抗菌肽（ribosomallysynthesizedpeptides）两类。根据抗菌肽的结构分为：（1）含α-螺旋的线性抗菌肽；（2）富含某些氨基酸残基的抗菌肽；（3）含1个二硫键的抗菌肽；（4）具有β-折叠结构的抗菌肽；（5）由已知多肽衍生的具有抗菌活性的肽[31]。根据抗菌肽的来源分为：（1）细菌抗菌肽，如多粘菌素、杆菌肽等；（2）昆虫抗菌肽，如天蚕素、昆虫防御素等；（3）植物源抗菌肽，如植物防御素、凤仙花素等；（4）蛙类动物抗菌肽，如蛙皮肽；（5）水生动物抗菌肽，包括鱼类、贝类、甲壳动物类抗菌肽，种类繁多复杂；（6）哺乳动物抗菌肽，主要有防御素（Defensins）、富组蛋白（Histatins）和Cathelicidins三种。鳖类肉味鲜美，营养丰富，富含蛋白质、脂肪、钙、铁以及多种维生素，而且全身各部分均可入药，具有滋阴清热，平肝益和破结软坚与消淤等功效，是我国传统的保健食品原料。近年来，国内外市场对甲鱼的需求日益增长，极大地促进了鳖养殖业和加工业的发展，但是目前，鳖主要以鲜活销售为主，加工产品少，产品附加值低，将其加工成高附加值的鳖肽具有巨大的发掘潜力，发展前景广阔，目前在鳖类血红蛋白中提取、纯化抗菌肽并研究其抗菌活性的研究却很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种纯度高、脱色效果好、活性高，可以快速杀灭细菌，的鳖类血红蛋白肽，该血红蛋白肽制备方法简单可行，酶解效率高。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，包括血红细胞提取、血红蛋白制备、酶解、脱色、分离，其具体步骤为：血红细胞提取：新鲜鳖类血中加入0.3-0.5wt%的柠檬酸三钠抗凝，然后置于温度为2-5℃、转速为3000-5000r/min的离心机中离心10-20min，弃去上清液，得到下层血红细胞，然后用0.7-1%的生理盐水清洗，再置于温度为2-5℃、转速为3000-5000r/min的离心机中离心10-20min，弃去上清液，即得血红细胞，新鲜的鳖类血含有大量的凝血因子和凝血酶原，在钙离子存在的情况下，会迅速被启动而发生作用，使血液凝结成团，血液由流动相变成胶状，所以该步骤对新鲜猪血进行抗凝处理，抑制猪血中凝血酶活性，避免可溶的纤维蛋白原在凝血酶的激活下变成不溶的维蛋白而凝固；血红蛋白制备：将血红细胞在-20至-15℃下冷冻10-15h，融化后按固液比为1:0.8-1.2加水，在超声功率为200-400W、间歇比1.5-2.5:1下超声破壁15-25min，即得血红蛋白溶液，本步骤采用冻融结合超声结合破壁，血红细胞破壁效果好；酶解：按加酶量为6-7wt%向血红蛋白溶液中加入复合蛋白酶，再加入磷酸二氢钾和乙二胺四乙酸二钠，然后在温度为35-40℃的条件下酶解3-5h，酶解结束后调节pH至3.5-4.5，静置40-60min后加热至沸腾，保持4-6min，然后在2-5℃的条件下冷却40-60min后过滤，滤液即为酶解液，该步骤采用Alcalase酶和胰蛋白酶进行酶解，能从不同的氨基酸位点进行酶切，产生大量的抗菌肽，效果优于单酶水解，同时酶之间因具有协同增效作用而导致加强效应，相应产生的多肽片段功能会进一步增强，最终提高血红蛋白的酶解效率和活性肽的活性；脱色：向酶解液中加入1.8-2.3wt%的活性炭，在温度为55-60℃、pH为4.0-4.5的条件下脱色40-60min，调节pH至中性，备用，血红蛋白酶解液中存在着血红素，在加工过程中，二价铁极易受温度、环境等影响成为三价铁，从而使产品变色，让人难以接受，本步骤利用活性炭吸附血红素使之与血红蛋白肽分离，脱色效果好，且不影响血红蛋白肽的抗菌活性；分离：将脱色后的酶解液经截留分子量为10-20kDa的超滤膜进行超滤，截留液再经400-600Da的纳滤膜纳滤，纳滤液冷冻干燥，即得血红蛋白肽。由于蛋白质的酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，分子量大小不等的多肽和游离的氨基酸，也含有脱色等过程中带入的杂质，该步骤分离属于物理方式，没有引入化学试剂，较好的保存了血红蛋白肽的原有特性，具有较好分离纯化效果。作为优选，酶解步骤中磷酸二氢钾的添加量为复合蛋白酶的6.4-8.2%，乙二胺四乙酸二钠的添加量为复合蛋白酶的0.2-0.4%。磷酸二氢钾和乙二胺四乙酸二钠的存在能使血红素上的丙酸基与珠蛋白结合的两个化学键及血红素中的铁与珠蛋白组氨酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂，从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离而在脱色过程中被活性炭吸附，提高脱色效果；同时能维持酶解过程中的pH稳定性，使得酶解反应速率能够保持，缩短酶解时间，且对血红蛋白肽的活性无影响。本专利技术还公开一种鳖类血红蛋白肽的制备方法制备的鳖类血红蛋白肽。该血红蛋白肽纯度高、脱色效果好、活性高，可以快速杀灭细菌，并有广谱的抗菌特性，对大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌均具有明显抗菌作用，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术血红蛋白肽纯度高、脱色效果好、活性高，可以快速杀灭细菌，并有广谱的抗菌特性，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域；本专利技术血红蛋白肽的制备方法简单可行，酶解效率高，能使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离而在脱色过程中被活性炭吸附，提高脱色效果，同时能维持酶解过程中的pH稳定性，使得酶解反应速率能够保持，且对血红蛋白肽的活性无影响。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，包括血红细胞提取、血红蛋白制备、酶解、脱色、分离，其具体步骤为：1）血红细胞提取：新鲜鳖类血中加入0.5wt%的柠檬酸三钠抗凝，然后置于温度为2℃、转速为5000r/min的离心机中离心10min，弃去上清液，得到下层血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，包括血红细胞提取、血红蛋白制备、酶解、脱色、分离，其特征在于：所述酶解步骤为：向血红蛋白溶液中加入复合蛋白酶，再加入磷酸二氢钾和乙二胺四乙酸二钠，进行酶解，酶解结束后灭酶，过滤，滤液即为酶解液。

【技术特征摘要】
1.一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，包括血红细胞提取、血红蛋白制备、酶解、脱色、分离，其特征在于：所述酶解步骤为：向血红蛋白溶液中加入复合蛋白酶，再加入磷酸二氢钾和乙二胺四乙酸二钠，进行酶解，酶解结束后灭酶，过滤，滤液即为酶解液。2.根据权利要求1所述的一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述复合蛋白酶为重量比为1:0.8-1.1的Alcalase酶和胰蛋白酶。3.根据权利要求1所述的一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述酶量为6-7wt%，酶解温度为35-40℃，酶解时间为3-5h。4.根据权利要求1所述的一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾的添加量为复合蛋白酶的6.4-8.2%，所述乙二胺四乙酸二钠的添加量为复合蛋白酶的0.2-0.4%。5.根据权利要求1所述的一种鳖类血红蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述血红细胞提取步骤为：新鲜鳖类血中加入0.3-0.5wt%的柠檬酸三钠抗凝，离心，弃去上清液，得到下层血红细胞，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建波，
申请(专利权)人：兰溪市沉默生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33