miR-494-3p的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了miR‑494‑3p在肺癌诊断领域中的新应用。本发明专利技术发现了miR‑494‑3p在非小细胞肺癌血清中表达上升，与肿瘤大小、临床病理分期、淋巴结转移等有联系，是潜在肺癌肿瘤诊断标志物，故本发明专利技术提供了miR‑494‑3p在肺癌诊断，特别是非小细胞肺癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了miR‑494‑3p的研究成果。

【技术实现步骤摘要】
miR-494-3p的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及miR-494-3p的应用。
技术介绍
肺癌是最常见的引起死亡的原因之一，在癌症引起的死亡中，肺癌的死亡率高达13％左右。其中有85％左右肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)。由于诊断时期较晚、放化疗耐受的原因，目前5年生存率仍然处于很低的位置。肺癌诊断中，能够在肺癌早期发现的病人只有不到16％的比例。中晚期病人治疗中，放疗和化疗引起的治疗抗性是肺癌疾病发展、肿瘤复发和高死亡率的重要原因。在过去的二十年，虽然肺癌诊断及发生发展方面的研究得到很大的进展，但在治疗抗性特别是药物治疗引起的药物耐受机制仍然处于未知的阶段，需要更多的努力去探索其分子机制，进而寻找提高肺癌病人生存率的更有效的治疗方法。microRNA(miRNA)是一类长度在18-25核苷酸长度的内源性小分子非编码RNA，在细胞内以一种特定类型的方式调节多种基因的转录后表达。miRNA形成包括两个步骤，先是细胞核内在核糖核酸酶Drosha和辅酶因子DGCR8作用下形成pre-miRNA，随后被Exportin5/Ran-GTP复合物运输到胞浆内经过Ago蛋白处理加工，形成具有活性的成熟miRNA发挥作用。成熟miRNA单链一般通过互补配对结合基因mRNA的3’UTR区域使基因表达受到抑制，进而通过特定基因表达沉默调控细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。而miRNA的调节异常会使整个细胞信号和生长过程平衡被打乱，引起包括癌症在内的各种疾病。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供miR-494-3p在肺癌诊断领域的新应用。miR-494位于染色体14q32.31的位置，成熟miR-494一般包括miR-494-5p和miR-494-3p两种类型，在多种癌症的组织、体液及细胞系中均能发现其特定的功能。本专利技术检测了miR-494-3p在非小细胞肺癌(NSCLC)与正常对照者血清中的含量，发现血清中miR-494-3p在非小细胞肺癌患者血清中含量高于正常人(p＜0.001)，而其他miRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)与正常对照者血清中的含量的差异性明显不如miR-494-3p显著，这表明了miR-494-3p可作为诊断肺癌，特别是非小细胞肺癌的潜在肿瘤标志物。对非小细胞肺癌诊断效率分析的结果显示，miR-494-3p的ROC分析AUC为0.872，95％置信区间：0.805-0.939。数据显示，血清中miR-494-3p对非小细胞肺癌早期诊断灵敏性和特异性在与其他miRNA比较中最高。此外，miR-494-3p的表达量在病理分期以及淋巴结转移中呈现显著性的差异，说明miR-494-3p的表达量与这两种病理特征呈明显的相关性。同时，非小细胞肺癌中I-II与III-IV期癌患者中miR-494-3p含量与对照之间均有显著性差异，且III-IV期癌患者中miR-494-3p含量最高，并与I-II期癌患者中miR-494-3p含量形成显著差异，这表明血清中miR-494-3p对非小细胞肺癌早期诊断具有重要的临床意义。以上种种试验结果表明，miR-494-3p可以作为肺癌，特别是非小细胞肺癌的肿瘤标志物，可通过能够检测miR-494-3p表达量的诊断试剂，比如引物、探针等，或整套试剂盒，比如扩增体系、引物、探针、酶等，对肺癌进行诊断。因此，本专利技术提出了miR-494-3p作为肺癌诊断标志物在制备肺癌诊断试剂和/或试剂盒中的应用。作为优选，所述肺癌诊断为肺癌早期诊断；所述试剂或试剂盒包括至少包括miR-494-3p扩增试剂，并可根据实际情况选择包括或不包括血清总RNA提取试剂和miRNA逆转录试剂；其中，所述miR-494-3p扩增试剂包括miR-494-3p扩增上/下游引物、SYBRPremixExTaqⅡ(2x)和ROXReferenceDye(50x)中的一种或两种以上；由以上技术方案可知，本专利技术发现了miR-494-3p在非小细胞肺癌血清中表达上升，与肿瘤大小、临床病理分期、淋巴结转移等有联系，是潜在肺癌肿瘤诊断标志物，故本专利技术提供了miR-494-3p在肺癌诊断，特别是非小细胞肺癌诊断领域的新应用，从而为该领域的疾病提供了新的诊断方法，也补充了miR-494-3p的研究成果。附图说明图1所示为四种miRNA在非小细胞肺癌患者和正常人血清中含量对比结果；纵坐标为miRNA的相对表达量，横坐标normal为正常人血清，NSCLC为非小细胞肺癌血清；A-D依次为miR-125a，miR-125b，miR-101-3p，miR-494-3p结果；图2所示为三种miRNA作为诊断标志物的ROC曲线分析；纵坐标为灵敏性，横坐标为特异性；图3所示为血清miR-494-3p作为非小细胞肺癌早期诊断标志物分析；左上图为利用均值±标准差方法分析normal、NSCLC-I-II期和NSCLC-III-IV三者两两之间的差异，其中*P<0.05，****P<0.0001，P值越小，差异越显著；剩余三图为normal、NSCLC-I-II期和NSCLC-III-IV三者两两之间的ROC曲线分析，作为早期诊断标志物的灵敏性和特异性，显示其诊断效率，曲线下面积越大，越有可能作为早期诊断的标志物；纵坐标为灵敏性，横坐标为特异性。具体实施方式本专利技术公开了miR-494-3p的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术通过从患者血清或者血浆中提取RNA，利用polyA加尾法逆转录(正向引物购买自广州市锐博生物科技有限公司，反向引物为TaKaRa通用引物)，反转录cDNA，然后再通过实时定量PCR反应扩增miR-494-3p并检测其在血清中的含量，与正常血清相比，相对含量高于正常血清值即可诊断为非小细胞肺癌，其中所涉及的步骤如下：A.血清总RNA的提取1)取-80℃冰箱保存的血清250mL，加入750mlTrizolLS，取移液器将其混匀，于室温放置10分钟裂解。2)加入200μL三氯甲烷，加速RNA相的分离，来回摇晃EP管15秒，室温静止15分钟后，于12000rpm离心10分钟。3)取上清液体400μL加入等体积异丙醇，室温静置10分钟后，12000rpm离心10分钟。4)加入用RNase-free去离子水配制的预冷75％乙醇清洗沉淀，8000rpm离心5分钟后，室温晾干。5)加30μLRNase-free的水溶解沉淀，-80℃保存。B.miRNA的逆转录cDNA第一条链的合成按照TaKaRa的Mir-XTMmiRNAFirst-StrandSynthesis试剂盒说明书进行。具体操作如下：1)在RNase-free的离心管中，加入表1试剂表1试剂体积(μL)mRQBuffer(2x)5RNAsample(0.25–8μg)3.75mRQEnzyme1.25总体积102)37℃孵育1小时，然后85℃终止本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑494‑3p作为肺癌诊断标志物在制备肺癌诊断试剂和/或试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-494-3p作为肺癌诊断标志物在制备肺癌诊断试剂和/或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述miR-494-3p序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肺癌诊断标志物为肺癌早期诊断标志物。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肺癌诊断试剂和/或试剂盒为肺癌早期诊断试剂和/或试剂盒。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗清，黄常志，张巧，赵玫，李燕，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52