本发明专利技术属于生物医学领域，涉及一种用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。SEPT9的正向引物选自SEQ ID NO：1~25的任意一条，SEPT9的反向引物选自SEQ ID NO:26‑51的任意一条，SEPT9的Blocker引物选自SEQ ID NO：52‑67中的任意一条，SEPT9的探针选自SEQ ID NO:68‑90中的任意一条。SDC2的正向引物选自SEQ ID NO：91~117的任意一条，SDC2的反向引物选自SEQ ID NO:118‑143的任意一条，SDC2的Blocker引物选自SEQ ID NO：144‑156中的任意一条，SDC2的探针选自SEQ ID NO:157‑174中的任意一条。相对于现有技术，本发明专利技术的有益效果是：同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平，灵敏度高，特异性好，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。
【技术实现步骤摘要】
用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种检测生物样本同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平的引物和探针组，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。
技术介绍
结直肠癌是一种最常见的恶性肿瘤，2015年中国癌症统计数据显示直肠癌均位列中国男性和女性癌症发病类型的前五位，且结直肠癌在过去十年中呈现出逐年上升的趋势。当前结直肠癌的初治分期比例为：I期占15％；II期占20％-30％；III期占30％-40％；IV期占20％-25％。在生存期方面，I期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的生存率。因此，实现结直肠癌的早期筛查从而达到早诊早治疗对于提高患者的生存率进而提升全面健康水平有着重要意义。肠镜作为结直肠癌筛查的金标存在诸多缺陷，该方法对操作者要求高，同时作为一种侵入性的检查方式，患者的痛苦大、接受度较低，目前的筛查率不足3％，因此导致中国的结直肠癌早期发现率远低于发达国家水平。目前结直肠癌检测方法有很多种，如粪便隐血试验、结直肠镜检、计算机扫描断层成像(CT)或粪便DNA检测，以上方法目前都得到了一定的应用，但也都存在一定的缺陷。结直肠镜镜检是目前结直肠癌筛查中灵敏度最高的方法，但是该方法要求专业的操作者进行操作，同时该方法价格昂贵，患者的接受度较低，在早期筛查结直肠上存在一定的缺陷。粪便隐血试验是作为一种快速检测方法，在结直肠癌筛查中也有广泛的应用，是特异性较低，因此存在大量的假阳性，而且检测结果易受要饮食和药物的干扰。其它方法如CT只能检测到中晚期的癌症，因此无法在早期筛查中应用；而粪便DNA筛查技术检测结果易被粪便中杂质干扰，而且当前粪便DNA检测方法是同时筛查多个生物标记物，且检测成本极高，当前在中国这样的发展中国家难以推广，同时，过于繁琐的操作步骤，也使得其难以在医院推广使用。非正常DNA甲基化与很多疾病的发生和维持有着紧密联系，特别是近年来的研究成果表明DNA甲基化在癌症的诱发和维持中起着重要作用，使之成为很多癌症的很好的生物标志物。SEPT9是一种非常有效的癌症DNA甲基化标记物，已有研究证明SETP9在结直肠癌组织和正常组织中呈现明显的表达差异。多配体蛋白聚糖-2(SDC2)蛋白常作为一种整合膜蛋白起作用，已知其通过胞外基质蛋白受体参与细胞增殖、迁移和细胞间相互作用。SDC2基因在间充质细胞而不是正常结肠组织的上皮细胞中表达，已有研究表明，结直肠癌患者呈现高频SDC2的异常甲基化。
技术实现思路
本专利技术针对当前结直肠癌早期筛查/检测/诊断方法的缺陷，提供了一种同时检测生物样本中SEPT9和SDC2基因甲基化水平的引物和探针组，通过提取生物样本中的DNA，采用荧光定量PCR技术，检测生物样本中是否含有甲基化的SEPT9或SDC2基因，从而实现结直肠癌的早期筛查/检测/诊断。为解上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。SEPT9的正向引物选自SEQIDNO：1～25的任意一条，SEPT9的反向引物选自SEQIDNO:26-51的任意一条，SEPT9的Blocker引物选自SEQIDNO：52-67中的任意一条，SEPT9的探针选自SEQIDNO:68-90中的任意一条。SDC2的正向引物选自SEQIDNO：91～117的任意一条，SDC2的反向引物选自SEQIDNO:118-143的任意一条，SDC2的Blocker引物选自SEQIDNO：144-156中的任意一条，SDC2的探针选自SEQIDNO:157-174中的任意一条。还含有一组内参基因引物探针组，其中所述内参基因为ACTB；所述ACTB的正向引物为SEQIDNO：175，反向引物为SEQIDNO:176，ACTB的探针选自SEQIDNO:177。检测对象为从生物样本中经过基因组DNA提取、纯化后再使用亚硫酸氢盐转化、再纯化得到的DNA样本(其作为PCR反应体系的DNA模板，亚硫酸氢盐转化后经过常规的纯化操作得到PCR所需DNA模板)。所述的亚硫氢盐为亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠和无水硫酸钠中的一种或多种，亚硫酸氢盐的浓度为8～10M；亚硫酸氢盐转化过程的反应条件为：DNA加入到8～10M亚硫酸氢盐溶液中，70～90℃加热30～60分钟。SEPT9、SDC2、ACTB甲基化的检测同时在一个荧光定量PCR反应中完成或单独针对一个位点(SEPT9、SDC2或ACTB)进行荧光定量PCR反应。SEPT9的Blocker引物和/或SDC2的Blocker引物在3’末端修饰磷酸基、C3、C9、C18中的一种。本专利技术还提供包含前述的引物和探针组的扩增体系，扩增体系具体组分为本专利技术还提供用于检测生物样本中SEPT9和SDC2甲基化的引物和探针组作为结直肠癌及其癌前病变的早期筛查/检测/诊断的试剂的应用；还提供前述的扩增体系作为结直肠癌及其癌前病变的早期筛查/检测/诊断的试剂的应用。相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平，灵敏度高，特异性好，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。附图说明图1为1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SEPT9基因扩增曲线图；图2为1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SDC2基因扩增曲线图；图3为SEPT9单一引物探针组和SEPT9与SDC2组合引物探针组检测甲基化SEPT9和效果图；图4为SDC2单一引物探针组和SEPT9与SDC2组合引物探针组检测甲基化SDC2效果图；图5为SEPT9和SDC2引物探针组合检测17例结直肠癌组织及对应癌旁组织的效果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1以已知SEPT9和SDC2基因全甲基化的细胞系的基因组序列为DNA模板，使用8M亚硫酸氢铵溶液，70℃加热60分钟对DNA模板转化后，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR反应。PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。表1实施例1的PCR反应体系组分终浓度PCR反应缓冲液1XDNA聚合酶0.1U/μLdNTPs混合液0.4mMMg2+2mMSEQIDNO:200.5μMSEQIDNO:380.5μMSEQIDNO:530.4μMSEQIDNO:790.1μMSEQIDNO:990.2μMSEQIDNO:1270.2μMSEQIDNO:1440.1μMSEQIDNO:1670.1μMSEQIDNO:1750.2μMSEQIDNO:1760.2μMSEQIDNO:1770.1μM去离子水补水至15μL转化后DNA模板15μL其中，SEQIDNO:53和SEQIDNO:144的3’端分别使用磷酸基和C3修饰。反应体系为15ul反应液加上15ul的转化后DNA模板，总体积30ul。15ul反应液为除了转化后DNA模板以外的其余组分。以下同。表2PCR反应条件图1为实施例1的1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SEPT9基因扩增曲线，图2为实施例1的1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。
【技术特征摘要】
1.用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。2.如权利要求1所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，SEPT9的正向引物选自SEQIDNO：1～25的任意一条，SEPT9的反向引物选自SEQIDNO:26-51的任意一条，SEPT9的Blocker引物选自SEQIDNO：52-67中的任意一条，SEPT9的探针选自SEQIDNO:68-90中的任意一条。3.如权利要求1或2所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，SDC2的正向引物选自SEQIDNO：91～117的任意一条，SDC2的反向引物选自SEQIDNO:118-143的任意一条，SDC2的Blocker引物选自SEQIDNO：144-156中的任意一条，SDC2的探针选自SEQIDNO:157-174中的任意一条。4.如权利要求1所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，还含有一组内参基因引物探针组，其中所述内参基因为ACTB；所述ACTB的正向引物为SEQIDNO：175，反向引物为SEQIDNO:176，ACTB的探针选自SEQIDNO:177。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：赵国栋，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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