本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，所述的引物包含SFRP2的正向引物和反向引物，所述的探针为SFRP2探针，SFRP2的正向引物包含SEQ ID:1‑16中的任意一条序列，SFRP2的反向引物包含SEQ ID:17‑30中的任意一条序列。相对于现有技术，本发明专利技术的有益效果是：通过提取生物样本中的DNA，采用荧光定量PCR技术，检测生物样本中是否含有甲基化的SFRP2基因，从而判断是否患有消化道肿瘤的风险；可以很好的检测到SFRP2甲基化序列，检测灵敏度可达到10拷贝/反应；甲基化的SFRP2基因可以明显区分结直肠癌、胃癌、食管癌等消化道癌症的癌症样本和正常样本。
【技术实现步骤摘要】
一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，用于结直肠癌、食管癌及胃癌等消化道肿瘤的早期诊断/检测。
技术介绍
消化道肿瘤(食管癌，胃癌和结直肠癌)是最常见的恶性肿瘤，2016年在影响因子144.8的《CA：ACancerJournalforClinicians》杂志上发表的2015年中国癌症统计数据显示食管癌，胃癌和结直肠癌均位列中国男性和女性癌症发病类型的前五位，且结直肠癌在过去十年中呈现出逐年上升的趋势。当前消化道癌的早期诊治比例很低，以结直肠癌为例：结直肠癌的初治分期比例为：I期占15％；II期占20％-30％；III期占30％-40％；IV期占20％-25％。在生存期方面，I期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的生存率。因此，实现消化道癌的早期筛查从而达到消化道癌的早诊早治疗对于提高患者的生存率进而提升全面健康水平有着重要意义。当前消化道癌早期筛查手段主要还是内窥镜，但是由于该类方法要求专业的操作者进行操作，难以推广，同时作为一种侵入性的检查方式，患者的接受度较低，因此导致中国的消化道癌早期发现率远低于发达国家水平。非正常DNA甲基化与很多疾病的发生和维持有着紧密联系，特别是近年来的研究成果表明DNA甲基化在癌症的诱发和维持中起着重要作用，使之成为很多癌症的很好的生物标志物。例如研究表明SFRP2等基因的甲基化与结直肠癌的发病有一定的相关性。从早期胚胎发育的角度考虑，从咽至直肠上端的绝大部分消化系统具有很高的同源性，因此消化道肿瘤的发病机理和分子表征很可能具有一定的相似之处。
技术实现思路
本专利技术针对当前消化道肿瘤早期诊断/筛查方法的缺陷，提供一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，通过提取生物样本中的DNA，采用荧光定量PCR技术，检测生物样本中是否含有甲基化的SFRP2基因，从而判断是否患有消化道肿瘤的风险。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，所述的引物包含SFRP2的正向引物和反向引物，所述的探针为SFRP2探针，SFRP2的正向引物包含SEQID:1-16中的任意一条序列，SFRP2的反向引物包含SEQID:17-30中的任意一条序列(表1)。SFRP2探针包含SEQID：31-42中任意一条序列。SFRP2探针标记的荧光为FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TexasRed，CY3,CY5，CY5.5及TAMRA中的任意一种。检测用的DNA模板为经过亚硫酸氢盐转化后的DNA。所述的亚硫氢盐为亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠和无水硫酸钠中的一种或多种，亚硫酸氢盐的浓度为8～10M；亚硫酸氢盐转化过程的反应条件为：DNA模板加入到8～10M亚硫酸氢盐溶液中，70～90℃加热30～60分钟。待检测的生物样本为血液、粪便、组织、尿液或其它可提取DNA的生物样本。所述的引物和探针组用于荧光定量PCR，其用于检测生物样本中SFRP2甲基化，PCR反应体系为优选地，SFRP2正向引物为SEQID:1～3的一个序列，SFRP2反向引物为SEQID:17、22和26中的一个序列，SFRP2探针为SEQID:31、34和37中的一个序列。一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组作为消化道肿瘤及癌前病变的早期诊断/检测/筛查的试剂的应用。所述的消化道肿瘤包括食管癌、胃癌、结直肠癌。相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：通过提取生物样本中的DNA，采用荧光定量PCR技术，检测生物样本中是否含有甲基化的SFRP2基因，从而判断是否患有消化道肿瘤的风险；可以很好的检测到SFRP2甲基化序列，检测灵敏度可达到10拷贝/反应；甲基化的SFRP2基因可以明显区分结直肠癌、胃癌、食管癌等消化道癌症的癌症样本和正常样本。附图说明图1为实施例1中的荧光定量PCR反应体系检测1000拷贝、100拷贝、10拷贝的甲基化的SFRP2示意图；图2为SFRP2引物探针组检测16例结直肠癌癌症组织与对应癌旁组织效果示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。表1引物和探针其中，Y表示C或T。实施例1以已知SFRP2基因全甲基化的细胞系的基因组序列为DNA模板，DNA模板在PCR反应前先经过亚硫酸氢盐处理，使用亚硫酸氢盐浓度为8M的亚硫酸氢铵溶液，反应条件为70℃加热60分钟，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR。采用SEQIDNO.1、SEQIDNO.17和SEQIDNO.37，进行荧光定量PCR反应，其中SEQIDNO.37标记的荧光为ROX；PCR体系和反应条件如表2和表3。表2实施例1的PCR组分组分终浓度PCR反应缓冲液1XDNA聚合酶0.1U/μLdNTPs混合液0.2mMMg2+5mMSEQIDNO:10.2μMSEQIDNO:170.2μMSEQIDNO:370.1μM去离子水补水至15μL转化后DNA模板15μL反应体系为15ul反应液加上15ul的转化后DNA模板，总体积30ul。15ul反应液为除了转化后DNA模板以外的其余组分。以下同。表3实施例1的PCR反应条件图1为实施例1中的荧光定量PCR反应体系检测1000拷贝、100拷贝、10拷贝的甲基化的SFRP2基因的示意图，由图1可以看出，实施例1可以很好的检测到SFRP2甲基化序列，检测灵敏度可达到10拷贝/反应。实施例2以结直肠癌组织和匹配的癌旁组织为检测对象，采用凯杰的DNeasyBlood&TissueKit提取DNA后，使用10M的亚硫酸氢盐进行处理，所用的亚硫酸氢盐溶液为6M亚硫酸氢铵、3M的亚硫酸氢钠的混合溶液和1M无水硫酸钠的混合溶液，反应条件为80℃加热40分钟，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后进行PCR。采用SEQIDNO.2、SEQIDNO.22和SEQIDNO.31，其中SEQIDNO.31标记的荧光为JOE，进行荧光定量PCR反应检测16例结直肠癌组织及其癌旁组织样本。PCR体系和反应条件如表4和表5。表4实施例2的PCR组分组分终浓度PCR反应缓冲液1XDNA聚合酶0.08U/μLdNTPs混合液0.4mMMg2+3mMSEQIDNO:20.4μMSEQIDNO:220.4μMSEQIDNO:310.2μM去离子水补水至15μL转化后DNA模板15μL表5实施例2的PCR反应条件图2为SFRP2引物探针组检测16例结直肠癌癌症组织与对应癌旁组织效果图，由图2可以看出，SFRP2在结直肠癌癌症组织中和癌旁组织中的甲基化水平差异明显。实施例3检测样本为10例食管癌患者血清cfDNA、31例胃癌血清cfDNA和36例无明显胃肠道疾病病人的血清cfDNA，血清体积为1mL。采用苏州唯善生物科技有限公司的cfDNA提取试剂盒进行DNA提取后，使用9M的亚硫酸氢盐进行处理，所用的亚硫酸氢盐溶液为9M亚硫酸氢铵溶液，反应条件为90℃加热30本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，所述的引物包含SFRP2的正向引物和反向引物，所述的探针为SFRP2探针，SFRP2的正向引物包含SEQ ID:1‑16中的任意一条序列，SFRP2的反向引物包含SEQ ID:17‑30中的任意一条序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，所述的引物包含SFRP2的正向引物和反向引物，所述的探针为SFRP2探针，SFRP2的正向引物包含SEQID:1-16中的任意一条序列，SFRP2的反向引物包含SEQID:17-30中的任意一条序列。2.如权利要求1所述的一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，SFRP2探针包含SEQID：31-42中任意一条序列。3.如权利要求1所述的一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，SFRP2探针标记的荧光为FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TexasRed，CY3,CY5，CY5.5及TAMRA中的任意一种。4.如权利要求1所述的一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，检测用的DNA模板为经过亚硫酸氢盐转化后的DNA。5.如权利要求4所述的一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，其特征在于，所述的亚硫酸氢盐为亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠和无...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵国栋，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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