检测环状RNA circMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测环状RNA circMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用及试剂盒。特别是实时荧光定量分析法辅助诊断肿瘤的制剂。通过研究证实circMAN1A2在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌及肺癌患者血清中表达上调。因此，将circMAN1A2的表达情况用于肿瘤的辅助诊断，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】
检测环状RNAcircMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用及试剂盒
本专利技术属于肿瘤分子生物学
，具体涉及一种检测环状RNAcircMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用和相应的试剂盒。
技术介绍
恶性肿瘤严重危害着人类的健康，近年来中国恶性肿瘤发病率呈现上升的趋势。据中国癌症统计中心统计，恶性肿瘤新发病数约为380.4万例，其中男性患者211.4万例，女性患者169.0万例，大约每一天超过1万人次能被确诊为癌症，大约每分就有7人次被确诊为癌症。恶性肿瘤发病率为278.07/10万，其中男性恶性肿瘤的发病率为301.67/10万，女性恶性肿瘤发病率为253.29/10万。恶性肿瘤发病率的中标率为190.63/10万(人口标准率按2000年中国的标准人口结构),恶性肿瘤发病率世标率为186.53/10万(人口标准率按Segi's世界标准人口结构)，0-74岁的累积发病率大约为21.58％。恶性肿瘤死亡率大约为167.89/10万，其中中标率约106.98/10万，世标率约106.09/10万，0-74岁的累积死亡率约为12.00％。据美国癌症协会(ACS)统计，美国恶性肿瘤预计新发病数约173.5万例，日均新发4700例。但上世纪90年代起美国恶性肿瘤的发病率开始稳步下降，同时恶性肿瘤死亡率也以每年1.5％的速度下降。美国恶性肿瘤发病率的明显下降，可能归因于控制吸烟、推广多层次癌症筛查及癌症新型疗法的广泛应用。由此可见，减少恶性肿瘤的发病因素、有效的早期诊断及新型癌症治疗方法的探索对癌症的控制有着重大的作用。所以我国的医学研究中正致力于寻找新型的肿瘤标志物，以期为恶性肿瘤的早期诊断，以及尽早方便准确的确诊病情从而有利于治疗提供新的途径。环状RNA(circualRNA,circRNA)是一类新的RNA分子，其构型与传统的线性RNA(含5’和3’末端)不同，环状RNA分子呈封闭环状结构(即5’和3’端首尾相连)，由于没有游离的5’和3’末端，因此环状RNA比线性RNA更加稳定。起初circRNA被认为是一种拼接错误的副产物，并未受到广泛的关注，近年来，基于新一代测序技术的RNA-Sequencing广泛应用推动了RNA许多领域的飞速发展，大量新的circRNA被发现，从而把circRNA推向了恶性肿瘤基因组学研究的舞台中央。circRNA作为一种新兴的RNA，其行成以及功能机制吸引着越来越多的研究。随着越来越多的circRNA被鉴别，发现一些circRNA的表达水平远远高于其相关线性基因的表达。circRNA以共价键形成环状结构，多数circRNA是反向拼接的产物，在机体广泛的表达，有时其表达水平是线性RNA的10倍，大多定位于胞质。CircRNA可以作为miRNA的分子海绵吸附miRNA、结合蛋白质、或作为基因转录和蛋白翻译的调控因子等发挥重要的生物学功能，很有可能成为恶性肿瘤新的生物标志物和临床治疗靶标，为肿瘤的诊断及预后提供新思路。因此，需要筛选和验证更多的新型circRNA作为癌症诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该
的国际竞争力。
技术实现思路
本专利技术从RNAseq数据中筛选出高表达的circRNA，并分别在多种类型的癌症中先后验证它们的表达情况，寻找到新兴的circRNA能够作为诊断恶性肿瘤的血清分子标志物。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种检测环状RNAcircMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用，所述的环状RNAcircMAN1A2的序列如SEQNo.1所示。为肿瘤辅助诊断提供了一种新的准确可靠的，简便的检测途径。血清作为检测样本，相比于组织检测，样本获取方式以及操作方便，成本低，准确性高，用于肿瘤的诊断非常理想。因此，申请人在研究过程中采用血清作为样本，通过大量试验寻找和验证血清中与肿瘤诊断相关的分子，以及他们与肿瘤之间存在的关系。申请人首次发现一种在血清中存在的环状RNAcircMAN1A2与多种类型的肿瘤存在正相关的关系，通过检测其在血清中的含量，可以方便的用于辅助或者初步诊断患有肿瘤的可能性。本专利技术采用SYBR-qPCR或者Taqmanprobeq-PCR的实验方法分别在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌及肺癌中先后验证circMAN1A2的表达情况。由于本专利技术用于验证circMAN1A2的表达情况所收集的样本数充足，具有统计学意义，而且样本来源合理，筛选标准严格，试验过程严谨，结果真实可靠。本专利技术在验证过程中选取的肿瘤基本囊括了从人体头颈部，以及内脏器官出现的有代表性的多发性的肿瘤类型。而且试验结果显示circMAN1A2在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌及肺癌患者血清中表达均明显上调，呈现出在多种类型肿瘤中表达趋势的一致性，预示着该circMAN1A2分子可以作为肿瘤诊断的分子标记物。上述应用中，所述的检测环状RNAcircMAN1A2的试剂包括实时荧光定量检测试剂。由于环状RNA结构的特殊性，为了确保引物的特异性和qPCR的精确性，申请人严格遵循环状RNA引物设计原则，设计出能准确扩增用于实时荧光定量检测环状RNAMAN1A2表达的引物：上游引物：5’-AGATGGGCAAAGATGGATTGA-3’下游引物：5’-GCCTTCTCATGATCAGCTCG-3’。本专利技术的第二个目的是提供一种用于肿瘤辅助诊断的试剂盒；为肿瘤辅助诊断提供了一种新的准确可靠的检测产品。所述的试剂盒含有能检测血清中环状RNAcircMAN1A2的试剂。进一步的，是含有能扩增环状RNAcircMAN1A2的引物；所述的环状RNAMAN1A2的序列如SEQNo.1所示。进一步的，所述的能扩增环状RNAcircMAN1A2的引物优选以下引物：上游引物：5’-AGATGGGCAAAGATGGATTGA-3’下游引物：5’-GCCTTCTCATGATCAGCTCG-3’。但本专利技术所述的能扩增环状RNAcircMAN1A2的引物不限于上述提供的引物。由于人类血清中无内参基因，我们优选加入了pGL3质粒作为参照，来减少RNA抽提过程中的误差，例如RNA吸附效率、洗脱效率的差异，同时也为研究提供更加可靠的实验数据。因为定量加入的pGL3质粒，就可以依据q-PCR反应所得的CT值计算出目标基因相对应的拷贝数，从而可以达到绝对定量。外参基因的加入，减少了实验中存在的系统误差，从而为研究提供可信度更高的数据信息。因此，进一步的，本专利技术所述的试剂盒还包括：内参pGL3引物：上游引物：5’-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3’下游引物：5’-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3’。但本专利技术的内参引物不仅仅限于上述提供的内参pGL3引物。Taqman探针具有高度的特异性，灵敏度高且特异性较好。SYBR法需要在不同EP管中进行PCR反应，而Taqman探针法可以实现在一个EP管中同时检测多个基因，从而又减少了实验误差。Taqmanprobe-qPCR的实验方法较严谨，信度与可重复性较高，并且可以多种样本同时检测，实验的可重复性好，实验所获得的数据更为可靠，为临床应用价值的评判提供扎实的基础。因此，进一步的，本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测环状RNA circMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用，所述的环状RNA circMAN1A2的序列如SEQ No.1所示。

【技术特征摘要】
1.检测环状RNAcircMAN1A2的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用，所述的环状RNAcircMAN1A2的序列如SEQNo.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测环状RNAcircMAN1A2的试剂为检测血清中环状RNAcircMAN1A2的试剂。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，肿瘤类型包括：鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌及肺癌中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的检测环状RNAcircMAN1A2的试剂包括实时荧光定量检测试剂。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测环状RNAcircMAN1A2表达的引物：上游引物：5’-AGATGGGCAAAGATGGATTGA-3’下游引物：5’-GCCTTCTCATGATCAGCTCG-3’。6.一种用于肿瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，含有能检测血清中环状RNAcircMAN1A2的试剂；所述的环状RNAcircMAN1A2的序列如SEQNo.1所示。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾朝阳，熊炜，郭灿，李桂源，李小玲，王金鹏，熊芳，向波，唐艳艳，范春梅，刘凌云，赵瑾，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43