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用于超突变型肿瘤分子分型的基因及其应用制造技术

技术编号:19448289 阅读:258 留言:0更新日期:2018-11-14 17:13
本发明专利技术公开了一种用于超突变型肿瘤分子分型的基因,可以区分超突变型的结直肠癌、肺鳞状细胞癌和皮肤黑色素瘤中预后较差和预后较好的患者。可提示对两组患者使用不同的治疗方法,对预后差的患者应用免疫治疗可获得良好的收益,有较好的临床指导意义。本发明专利技术还公开了用于捕获上述基因的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于超突变型肿瘤分子分型的基因及其应用
本专利技术属于生物
,涉及一个针对多种超突变型肿瘤进行分子分型的基因,及该基因在预判肿瘤免疫治疗短期缓解和长期获益情况中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤目前已成为一个全球性公共健康问题。近三十年以来,癌症发病数以年均3%‐5%的速度递增,癌症已成为人类第一位死因。手术、化疗和放疗是传统的癌症治疗手段,目前多数早期患者通过综合治疗后可以获得较好的预后,但这些治疗无法降低所有肿瘤患者的死亡率,因此急需发展更有效的治疗手段。自2012年新英格兰杂志报道了两个里程碑式的临床试验后,免疫治疗进入了迅猛发展的新时代。以抗PD‐1/PD‐L1药物为代表,已开展的大量临床实验显示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。如帕姆单抗(Keytruda),其适应症已经从非小细胞肺癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌等,扩展到了所有微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability,MSI)或错配修复基因系统缺陷(mismatchrepairdeficiency,dMMR)的实体瘤患者。而对于占患者多数的微卫星稳定型肿瘤,已有多个免疫治疗联合传统化疗的临床实验在实施。截止2017年下半年,全球肿瘤免疫疗法相关产品2004个,临床实验3024个,预计将会有多达58万名患者被招募,其中靶向PD‐1/PD‐L1的抗体,已有5个药物上市,160个正在开发中,涉及临床实验1502个。这些证据都表明免疫治疗将不再停留在标准治疗失败后的后线治疗,免疫治疗的地位将前移并且进入辅助治疗阶段,肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗不可或缺的一环。随着以抗PD‐1/PD‐L1为代表的各种免疫治疗应用范围日益扩大,筛选能从治疗中获益的患者,剔除不能获益的患者免于遭受免疫治疗相关不良反应的伤害,已经迫在眉睫。然而目前尚缺少理想的生物标志物用于筛选获益的患者。肿瘤组织的PD‐L1表达被证明在黑色素瘤等中与治疗缓解情况相关,高表达者可获益。但PD‐L1的检测方法、最佳界限、细胞异质性等都存在不确定性,并且PD‐L1的表达动态受治疗等因素的影响,因此尚不能准确预测治疗反应。肿瘤浸润淋巴细胞,如肿瘤边缘CD8+细胞密度等,也被认为和免疫治疗的反应密切相关。微卫星不稳定也是提示免疫治疗疗效的重要分子特征。在微卫星高度不稳定的结直肠癌中,突变的基因位点数量可以是其他结直肠癌的几十到上百倍,并表现为免疫反应的相关基因大量上调,大量肿瘤新生抗原导致的强免疫原性可能是免疫治疗良好反应的原因。但根据最近对8万多例各类肿瘤的测序结果表明,在有大量基因突变的超突变肿瘤中,微卫星不稳定占多数但不是全部,另外一大部分由POLE或POLD1的突变造成,这两个基因的功能性突变可造成细胞中基因错配修复系统的缺陷,进而导致肿瘤细胞中大量突变的出现。以上证据表明现有标志物并不能很好的提示免疫治疗的反应情况和最终受益可能,亟需筛选一个更佳的标志物,可以更好判断肿瘤患者能否从免疫治疗中获益,但考虑到临床实际应用的便利性,应该包括尽可能少的指标,并且能够在一次检测中完成。结直肠癌是我国常见癌症之一。近几十年来,结直肠癌发病率年均上升3%~4%,但地区差异较大,如上海2012年发病率达56/10万。世界卫生组织国家癌症研究代表处(InternatinalAgencyforResearchonCancer,IARC)发表的Globocan2012估算中国大陆结直肠癌标化发病率为14.2/10万,居世界第75位,标化病死率7.4/10万,据世界第78位。我国结直肠癌发病率和死亡例数分别占全世界发病和死亡总例数的18.6%和20.1%,均居第1位。根据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告,我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位,病死率分别居第4位和第5位。结直肠癌也是在免疫治疗方面走在前面的癌种,对免疫治疗敏感的微卫星不稳定型比例很高,相关各种临床实验在大量开展。因此我们对结直肠癌的基因组突变谱进行了深入分析,筛选得到了结直肠癌基因突变特征,并逐个在独立的结直肠癌队列上做了验证。基于该基因突变特征建立的预后预测模型可对结直肠癌进行分子分型,从而筛选能从治疗中获益的患者,剔除不能获益的患者免于遭受免疫治疗相关不良反应的伤害。除结直肠癌以外,肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌等多种肿瘤也适用于免疫治疗,而且随着临床实验的大量开展,这个适用范围在日渐扩大。其他肿瘤的患者也亟需能判断能否从免疫治疗中获益的标志物。因此我们应用该基因预后预测模型对其他肿瘤也作了分析,以筛选可获益的患者。
技术实现思路
本专利技术针对目前肿瘤免疫治疗进展迅速,临床实验大量开展,但缺少理想的生物标志物用于筛选肿瘤患者中适合人群的现状,提供了一个用于预判多种超突变型肿瘤免疫治疗的短期缓解和长期获益情况的基因及其检测试剂盒。本专利技术提供一个用于超突变型肿瘤分子分型的基因,该基因为DOCK2基因。本专利技术提供一种用于超突变型肿瘤分子分型的检测试剂盒,所述检测试剂盒包括捕获本专利技术所述用于超突变型肿瘤分子分型的基因的探针。其中,所述的检测试剂盒较佳地还包括:基因组DNA提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂,选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。其中,所述基因组DNA提取试剂为本领域常规的基因组DNA提取试剂。其中,所述文库构建试剂和二代测序试剂为本领域常规使用的试剂,只要能否满足对所得序列构建文库并进行二代测序的要求即可。所述的二代测序为本领域常规的二代测序。本专利技术所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械;更佳地,还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械,所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。本专利技术所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织,只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种,更佳地为组织样本,更佳地为石蜡组织样本,优选地为肿瘤细胞含量高的组织。本专利技术所述检测试剂盒适用于超突变型结直肠癌、超突变型肺鳞状细胞癌、超突变型皮肤黑色素瘤进行检测,使用方法如下:(1)提取血液和组织样本中的基因组DNA双链核酸;(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链,使用捕获探针捕获DOCK2基因的DNA单链;捕获区域如下:染色体编号:chr5;区域位置:169064321~169509872;区域:外显子区域及外显子内含子交接区域。针对捕获对象设计探针为本领域的常用技术手段,探针的序列包括但不限于染色体编号:chr5;区域位置:169064321~169509872;区域:外显子区域及外显子内含子交接区域。。(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行测序,得到血液和组织样本中的核酸序列;(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理,计算组织样本中的DOCK2基因的变异位点数量。若变异位点数量为0,则为DOCK2野生型;若变异位点数量大于0,本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.用于超突变型肿瘤分子分型的基因,其特征在于,该基因为DOCK2基因。

【技术特征摘要】
1.用于超突变型肿瘤分子分型的基因,其特征在于,该基因为DOCK2基因。2.如权利要求1所述的基因,其特征在于,所述肿瘤包括:超突变型的结直肠癌,超突变型的肺鳞状细胞癌,超突变型的皮肤黑色素瘤。3.如权利要求1所述的基因在制备用于超突变型肿瘤分子分型的试剂盒中的应用。4.一种用于超突变型肿瘤分子分型的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包含:捕获权利要求1中所述基因的探针。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员:葛维挺
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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