一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术首次公开了一种气体信号分子的应用及一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ‑聚谷氨酸的方法，本发明专利技术的气体信号分子为一氧化氮。具体步骤为：将保藏编号为CGMCC NO.5808的菌株SQR9过夜活化后，以1％接种量转接到灭菌的Landy培养基中；将一氧化氮供体DETA NONOate溶于水配制成100mM的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到S1所述的Landy培养基中至终浓度为1～40μM，37℃，170rpm震荡培养12h，得到发酵液；用醇沉淀的方法提取S2所述发酵液中的γ‑聚谷氨酸。本发明专利技术使解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ‑聚谷氨酸的能力显著提高，为微生物发酵提高γ‑聚谷氨酸的产量提供了新途径，对于旱作农业，食品工业，日化用品方面都具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种气体信号分子的应用及一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸是自然界中微生物(主要是芽孢杆菌属细菌)利用谷氨酸通过α-氨基与γ-羧基之间形成的γ-酰胺键聚合形成的水溶性可生物降解的阴离子型多聚氨基酸，具有无色透明、无毒、无味、吸水速度快等特点。细菌合成的γ-聚谷氨酸就产量而言，往往随所用菌株、发酵条件以及培养基中碳源、氮源、金属离子的种类和含量不同有很大的差异，而且分子量较大，从10kDa～1,000kDa不等，没有典型的肽链结构，基本骨架呈直链纤维状。γ-聚谷氨酸近年来在食品工业、制药业、化妆品生产和污水处理等方面具有广泛的应用前景。γ-聚谷氨酸可以被用作食品增稠剂、润湿剂、苦味缓释载体、防冻剂、保水剂、药物载体、可降解塑料、高分子生物絮凝剂、重金属吸附剂、动物食品添加剂等。在农业生产中由于γ-聚谷氨酸具有较强的亲水和保湿能力，将这种γ-聚谷氨酸与土壤结合，不仅可以改良土壤的团粒结构，还能改进土坡的保墒、保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用。γ-聚谷氨酸还可作为农业化学品的缓释载体，在肥料、除草剂、杀虫剂及其它农用化学品使用时，加入适量的γ-聚谷氨酸盐可以延长药物在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、下雨而被刷掉，从而延长活性成分的作用时间，同时提高了这些化学品的使用效果，这在一定程度上减少了化肥农药的使用量，对改善农用土壤的结构，降低农药的负面影响都有十分重要的意义。此外γ-聚谷氨酸还可增加植物对营养的吸收、提高作物产量，作为对环境友好的肥料增效剂。在微生物肥料生产中增加γ-聚谷氨酸的产量可以开发为保水微生物肥，对于旱作农业具有重要意义。因此，急需一种促进细菌合成γ-聚谷氨酸的有效途径。气体信号分子包括一氧化氮、一氧化碳和硫化氢。一氧化氮是第一个被确定的气体信号分子，其生物学效应的发现是一次革命，使人类第一次认识到气体也可作为重要细胞信号分子。气体信号分子具有传导信号通路的功能，进而调控相关生理事件。随着对一氧化氮作为气体信号分子的研究日益广泛，其在生命体系中的作用需要更深入地被了解，以便更好地对其功能进行调控。本专利技术从黄瓜根际土筛选到的一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9作为PGPR菌在作物根际发挥作用。解淀粉芽孢杆菌SQR9也可产生的γ-聚谷氨酸，为其发挥植物促生提供有力保障。目前，尚未有气体信号分子应用于提高芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸产量中报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种气体信号分子的应用及一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术的第一个目的是提供气体信号分子在促进解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸中的应用。进一步的，所述气体信号分子为一氧化氮。进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌SQR9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，于2012年2月27日保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.5808，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的第二个目的是提供利用权前述气体信号分子促进解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：S1：将保藏编号为CGMCCNO.5808的菌株SQR9过夜活化后，以1％接种量转接到灭菌的Landy培养基中；Landy培养基，1L培养基的配法为：1、葡萄糖20g，单独灭菌，115℃，30min。2、MgSO4·7H2O0.5g；KH2PO41g；KCl0.2g；MnSO4·H2O10mg；FeSO4·7H2O5mg；CuSO4·5H2O0.2mg；酵母粉1g；L-丙氨酸2mg；L-谷氨酸5g，用5M的NaOH调制pH＝6.7后,115℃，30min灭菌。1、2分别灭菌后混合在一起。S2：将一氧化氮供体DETANONOate溶于水配制成100mM的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到S1所述的Landy培养基中至终浓度为1～40μM，37℃，170rpm震荡培养12h或12h以上，得到发酵液；S3：用醇沉淀的方法提取S2所述发酵液中的γ-聚谷氨酸。进一步的，所述S2中DETANONOate终浓度为40μM。进一步的，所述S3中醇沉淀方法为：将发酵液4℃，8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min，取沉淀，加入与发酵液等体积的蒸馏水溶解。进一步的，所述S3提取后，还包括用CTAB法对γ-聚谷氨酸的含量进行测定的步骤。进一步的，S3得到的γ-聚谷氨酸分子量单一且大于300KDa。本专利技术的第三个目的是提供前述的应用或前述方法在γ‐聚谷氨酸作为发酵产品中的应用，特别是在旱作农业，食品工业，日化用品方面的应用。本专利技术敲除了菌株SQR9中一氧化氮合成酶(YflM)，得到突变体ΔyflM，其一氧化氮合成水平相对与野生型菌株SQR9下降了5倍，此突变株ΔyflM用来测量低水平下菌株SQR9中γ-聚谷氨酸的合成能力。DETANONOate作为一氧化氮供体能在液体环境下缓慢释放一氧化氮，使一氧化氮持续发挥作用。为保证一氧化氮促进γ-聚谷氨酸的效果，同时避免高浓度一氧化氮对菌株的毒性，本专利技术在1～40μM一氧化氮供体DETANONOate范围内设置梯度试验，在ΔyflM培养液中外源添加1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的一氧化氮供体DETANONOate来研究一氧化氮对γ-聚谷氨酸合成的影响，并在野生型SQR9中验证了其促进作用。本专利技术的技术方案与现有技术相比，有益效果在于：(1)本专利技术首次公开了气体分子一氧化氮具有提高解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸的能力，相对于解淀粉芽孢杆菌SQR9常规发酵生产γ-聚谷氨酸的产量提高了81％，为微生物发酵提高γ-聚谷氨酸的产量提供了新途径。(2)本专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌SQR9遗传稳定性强，可重复传代。(3)本专利技术使解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸的能力显著提高，对于旱作农业，食品工业，日化用品方面都具有重要意义。附图说明图1实施例1中一氧化氮合成酶对菌株SQR9合成一氧化氮的影响对比柱状图；图2实施例3中A为一氧化氮合成酶对γ-聚谷氨酸合成的影响对比柱状图，B为紫外吸收样品图；图3实施例4中SDS-PAGE检测菌株SQR9产生的γ-聚谷氨酸图谱；图4实施例5中A为一氧化氮对菌株SQR9合成γ-聚谷氨酸的影响对比柱状图，B为紫外吸收样品图；图5实施例5中一氧化氮对突变体ΔyflM合成γ-聚谷氨酸的影响对比柱状图。生物材料保藏信息：SQR9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年2月27日，保藏号为CGMCCNO.5808。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.气体信号分子在促进解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ‑聚谷氨酸中的应用。

【技术特征摘要】
1.气体信号分子在促进解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述气体信号分子为一氧化氮。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌SQR9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，于2012年2月27日保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.5808，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。4.利用权利要求1至3任一项所述气体信号分子促进解淀粉芽孢杆菌SQR9合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：将保藏编号为CGMCCNO.5808的菌株SQR9过夜活化后，以1％接种量转接到灭菌的Landy培养基中；S2：将一氧化氮供体DETANONOate溶于水配制成100mM的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到S1所述的Landy培养基中至终浓度为1～40μM，37℃，170rpm震...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞福，董小燕，邵佳慧，徐志辉，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32