与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用。该标志物为miR‑219a‑1‑3p和/或miR‑219a‑5p，采用qRT‑PCR对miR‑219a‑1‑3p和/或miR‑219a‑5p在克罗恩病中的表达水平进行检测，对克罗恩病的临床诊断和靶向治疗提供参考价值。该标志物用于克罗恩病临床诊断的准确性、灵敏度及特异度均较高，具有方便、快捷的优点，同时在一定程度上避免了肠镜检查的局限性。

【技术实现步骤摘要】
与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用
本专利技术属于医学分子生物学
，具体涉及一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用。
技术介绍
克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)是一种累及胃肠道的慢性、复发性、非特异性炎症性疾病。目前CD的病因和发病机制仍不清楚，但是越来越多的研究表明，CD4+T细胞过度激活介导的炎症免疫反应在CD发病过程中具有至关重要作用。近年来，CD在我国的发病率呈逐年上升趋势，该疾病常迁延不愈，病情易复发，有致残、癌变等风险，严重影响了患者生存质量，给社会造成了沉重的医疗经济负担。因此，阐明CD的具体发病机制，找到能够用于CD临床诊断标志物和治疗的新靶点，对我国CD临床防治研究具有重要意义。目前用于CD临床诊断的重要检查方法主要为内镜检查和组织病理学检查，创伤性较大。许多患者因病变导致肠腔严重狭窄，出现难以耐受肠镜检查或肠镜检查范围受限制等情况，且临床上目前仍缺乏与CD及其疾病活动性明显相关的特异性指标，使得CD临床诊断面临许多困难。由于缺乏特异性诊断标志物，部分CD常常难以与肠结核、缺血性肠炎和肠道肿瘤等疾病相鉴别，其治疗亦面临巨大挑战。因此，寻找CD的诊断标志物对临床上的诊疗过程来说是极其重要的，且对于CD的靶向治疗也具有积极意义。microRNA(miRNA)是一类由18-24个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，具有高度的保守性、表达多样性等特点。miRNA通过其5’端2-7个核苷酸(种子区)与靶基因mRNA的3’-UTR完全或不完全互补配对，导致靶基因转录抑制或降解，广泛参与细胞分化、成熟、增殖、凋亡、代谢等生物学过程。目前研究已发现多种miRNA在CD患者CD4+T细胞中表达异常，这些miRNA表达水平的改变与CD炎症反应严重程度密切相关，表明miRNA在CD诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。依据3’端和5’端序列不同，miR-219a-1可分别编码产生成熟的miR-219a-1-3p和miR-219a-5p分子。此外，miR-219a-2亦可编码产生成熟的miR-219a-5p分子。研究证实，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在多种慢性炎症、自身免疫性疾病、肿瘤(结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、恶性胶质瘤)等人体病理生理过程中发挥重要作用。但是，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在CD患者CD4+T细胞中的表达水平及作用均未有报道。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是提供一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用，该miRNA标志物对于克罗恩病诊断具有很高的灵敏度和特异性，可以作为新型的生物标志物用于克罗恩病的检测，为克罗恩病临床诊断提供参考依据。技术方案：与克罗恩病相关的miRNA标志物，该标志物为miR-219a-1-3p和/或miR-219a-5p，miR-219a-1-3p的RNA序列如SEQIDNO.1所示，miR-219a-5p的RNA序列如SEQIDNO.2所示。上述与克罗恩病相关的miRNA标志物在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。上述与克罗恩病相关的miRNA标志物在筛选或制备治疗克罗恩病靶向药物中的应用。用于检测上述miRNA标志物的引物对，对miR-219a-1-3p来说，上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物为通用反向引物；对miR-219a-5p来说，上游引物序列如SEQIDNO.4所示，下游引物为通用反向引物。上述引物对在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。一种检测克罗恩病的诊断试剂盒，含有上述引物对。进一步地，上述诊断试剂盒还包含PCR反应常用的试剂和酶。有益效果：1、本专利技术采用qRT-PCR对miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在克罗恩病中的表达水平进行检测，对克罗恩病的临床诊断和靶向治疗提供参考价值。2、miR-219a-1-3p和miR-219a-5p对克罗恩病均有一定的诊断价值，两者作为标志物用于克罗恩病诊断的特异性强，敏感性高，操作简单，结果稳定，具有广泛的临床应用前景。其联合诊断的AUC、灵敏度和特异度均优于单项miRNA测定，AUC曲线下面积最大，灵敏度和特异度都达到90％以上，是诊断克罗恩病的比较可靠的特异性生物标志物。附图说明图1为实施例1中miR-219a-1-3p在对照组和克罗恩病组的表达差异分析；图2为实施例1中miR-219a-5p在对照组和克罗恩病组的表达差异分析；图3为实施例1中miR-219a-1-3p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析；图4为实施例1中miR-219a-5p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析；图5为实施例1中miR-219a-1-3p和miR-219a-5p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步说明。实施例1miR-219a-1-3p和miR-219a-5p对克罗恩病的诊断1.化合物：miR-219a-1-3p和miR-219a-5p特异性逆转录及qRT-PCR引物。2.组合物：(1)miRNA逆转录试剂：5×ReverseTranscriptionBuffer，RTaseMix，RNase-freeH2O，逆转录引物。(2)miRNAqRT-PCR反应试剂：2×SYBRGreenMix(Taq酶、dNTPmix、PCRBuffer、SYBRGreenⅠ)；ddH2O；ROX染料；miR-219a-1-3p和miR-219a-5p特异性qRT-PCR上游引物(miR-219a-1-3p上游引物序列如SEQIDNO.3所示，miR-219a-5p上游引物序列如SEQIDNO.4所示)和通用下游引物。该方法基于特异性的茎环状RT引物及正反向引物，并采用SYBRGreen染料检测，无需荧光探针，具有高灵敏度和高特异性的优点。3.方法：(1)外周血CD4+T细胞分离：用肝素抗凝管采集克罗恩病患者和健康对照者外周静脉血5-10mL，按1:1比例与PBS混匀，缓慢加入等体积淋巴细胞分离液上层，注意液面分层，2000rpm梯度离心20分钟。细胞分层后，缓慢抽取中间云雾层细胞，使用PBS清洗、离心沉淀后即为外周血单个核细胞。使用CD4+T细胞分选磁珠(购自BDBiosciences)从外周血单个核细胞中提取CD4+T细胞，重复该步骤三次纯化CD4+T细胞即为所需样本。加入1mlTrizol后置于-80℃冰箱中保存。(2)RNA提取：取出预先准备好的克罗恩病患者和健康对照者CD4+T细胞标本，加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，置于室温下静置5min后离心，离心条件为4℃、12000rpm、15min。取出标本，缓慢吸取上层清液400mL，然后加入500mL异丙醇，缓慢混匀。室温下静置10min后离心，离心条件为4℃、12000rpm、10min。吸出全部液体，加入75％乙醇混匀后离心，离心条件为4℃、7500rpm、5min。离心结束后吸出乙醇，室温下迅速烘干RNA。加入适量DEPC水，使用ExperionAutomatedElectrophoresisSystem(美国Bio-RadLaboratories)检测RNA浓度及纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与克罗恩病相关的miRNA标志物，其特征在于：该标志物为miR‑219a‑1‑3p和/或miR‑219a‑5p，所述miR‑219a‑1‑3p的RNA序列如SEQ ID NO .1所示，所述miR‑219a‑5p的RNA序列如SEQ ID NO .2所示。

【技术特征摘要】
1.与克罗恩病相关的miRNA标志物，其特征在于：该标志物为miR-219a-1-3p和/或miR-219a-5p，所述miR-219a-1-3p的RNA序列如SEQIDNO.1所示，所述miR-219a-5p的RNA序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的miRNA标志物在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。3.权利要求1所述的miRNA标志物在筛选或制备治疗克罗恩病靶向药物中的应用。4.用于检测权利要求1所述的miR...

【专利技术属性】
技术研发人员：石岩，姚俊，许亚平，周勇，王涛，
申请(专利权)人：镇江市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32