一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法及试剂盒技术

技术编号:19448266 阅读:151 留言:0更新日期:2018-11-14 17:13
本发明专利技术公开了一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,涉及一种通过改进基于高通量测序的MeDIP‑Seq技术来检测少量样品(300pg DNA或50个细胞)全基因组DNA甲基化的方法。本发明专利技术通过在少量起始样品中补加含dUTP的λDNA以减少样品损失并提高建库和免疫沉淀反应的效率,通过USER酶对MeDIP‑DNA进行消化以除去补加的甲基化λDNA,避免了甲基化λDNA对待测甲基化样品测序文库的污染。本发明专利技术需样品量为300pg DNA或50个细胞,更加适用于少量来源样品的MeDIP‑Seq分析且本发明专利技术的MeDIP实验技术及其配套试剂盒的操作方法简便高效,不需要特定的商品化试剂盒和实验设备,成本较低,具有较广泛的适用性和通用性。

【技术实现步骤摘要】
一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及全基因组DNA甲基化的检测方法,尤其涉及一种通过改进基于高通量测序的MeDIP-Seq(MethylatedDNAimmunoprecipitationsequencing)技术来检测少量样品(300pgDNA或50个细胞)全基因组DNA甲基化的方法。
技术介绍
目前通过MeDIP-seq方法检测细胞全基因组DNA甲基化所需的最低DNA量为50ng,若以细胞为出发样品,则至少需要~75000个细胞(TaiwoOetal.,NatProtoc,2012),该方法的具体实验流程为:抽提细胞基因组DNA→超声断裂基因组DNA并通过AgilentBioanalyzer2100检测超声片段大小→对超声片段进行末端修复、3’端加dA、接头连接并将连接产物进行纯化和定量→在纯化产物中加入少量片段大小在100bp-500bp之间的λDNA(其中被甲基化的λDNA片段和未被甲基化的λDNA片段的摩尔比为4:1)→利用DiagenodeAuto-MeDIP和iPure试剂盒以及SX-8GIP-Star全自动样品处理系统进行MeDIP实验→根据加入的λDNA的量,通过qPCR检测MeDIP实验的回收率和特异性→PCR扩增MeDIP产物并对产物进行纯化,通过AgilentBioanalyzer2100检测PCR产物的片段分布和浓度→将PCR进行割胶回收和AgilentBioanalyzer2100检测→根据加入的λDNA,通过qPCR验证胶回收产物中甲基化DNA的富集倍数→将建库产物进行高通量测序和数据分析。现有技术的主要缺点有两个:①所需的最低样品起始量为50ngDNA或75000个细胞,仍不适用于少量来源样品的MeDIP-seq分析;②需要利用商品化试剂盒和全自动样品处理系统进行MeDIP-seq实验,成本较高,不具有普遍适用性。因此,本领域的技术人员致力于开发一种新的基于MeDIP-seq的检测方法,该方法能降低所需样品起始量,使MeDIP-seq更加适用于少量(300pgDNA或50个细胞)来源样品的DNA甲基化分析;不需要特定的商品化试剂盒和实验设备即可完成MeDIP实验,进一步简化操作流程,节约成本。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷,本专利技术所要解决的技术问题是降低所需样品起始量,使MeDIP-seq更加适用于少量(300pgDNA或50个细胞)来源样品的DNA甲基化分析;不需要特定的商品化试剂盒和实验设备即可完成MeDIP实验。为实现上述目的,本专利技术提供了一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:第一步:制备U取代T的未甲基化λDNA,并对λDNA进行甲基化,得到甲基化λDNA;第二步:将未甲基化的λDNA加入待抽提DNA的样品中并提取基因组DNA,或者直接加入待测甲基化的基因组DNA样品中;第三步:断裂DNA片段,使片段长度为100-500bp,第四步:将超声断裂后的DNA片段进行末端修复、3’端加dA和接头连接,得到连接产物,纯化连接产物;第五步:将纯化后的连接产物分为Input-DNA和待分析DNA,在所述待分析DNA中加入甲基化λDNA,混匀变性成单链DNA后通过抗体富集含甲基化DNA片段;第六步:将Input-DNA和富集后DNA片段分别进行USER酶消化,随后分别进行PCR扩增、纯化并回收片段大小为100-500bp的样品,得到高通量测序文库;第七步:对高通量测序文库进行定量后进行高通量测序和分析。进一步地,所述第一步中未甲基化λDNA是通过PCR制备的,所述甲基化λDNA是通过CpG甲基转移酶(CpGMethyltransferase)制备的,通过在PCR反应体系中使用dUTP取代dTTP,获得含dUTP的λDNA。进一步地,λDNA扩增的引物为:λDNA-F:TGTGGGGTGAATATGGCAGTλDNA-R:CGTCGATTTGGTGCCGTAAT进一步地,所述第二步中待抽提DNA的样品最低为50个细胞,所述待测甲基化的基因组DNA样品最低为300pg。在本专利技术一个优选的实施方案中,样品量为300pgDNA或50个细胞,加入的未甲基化λDNA量为1ug。进一步地,所述第三步中断裂DNA片段的方法为超声断裂,优选长度为200-500bp。进一步地,所述第四步是按照KAPAHyperPrepKit提供的实验方案进行的进一步地,所述连接产物通过用AgencourtAMPureXPbeads进行纯化。在本专利技术一个优选的实施方案中,所述第六步中InputDNA与待分析DNA的比为1:9。进一步地,所述第五步中甲基化DNA片段是通过MeDIP(MethylatedDNAimmunoprecipitation)、MethylCap(MethylatedDNAaffinitycapture)或MBD(MethylatedDNAbindingdomain)等方法进行富集的。在本专利技术的一个优选实施方案中,所述甲基化的DNA片段是通过MeDIP方法进行的。在本专利技术的一个较佳的实施方案中,所述第六步和第七步中间还包括使用qPCR验证甲基化DNA的富集效率和特异性,通过qPCR检测结果,为高通量测序提供依据。本专利技术还提供了一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括U取代T的未甲基化λDNA、U取代T的未甲基化λDNA和USER酶,并利用上述少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法进行检测。本专利技术还提供了一种少量样品ChIP-Seq的分析方法,其特征在于,在所述少量样品中加入U取代T的未甲基化λDNA,将混合的DNA样品进行末端修复、3’端加dA、接头连接和纯化,减少ChIP-DNA在各步操作中的损失并提高ChIP-DNA的接头连接效率,在PCR扩增前,通过USER酶消化除去甲基化λDNA,避免了甲基化λDNA对ChIP样品的污染。本专利技术的技术原理:因为MeDIP-seq分析的实验流程包括多个操作步骤,如DNA的抽提、纯化、超声、建库、免疫沉淀等,每一步都会有少量的样品损失,并且对于建库和免疫沉淀这两个步骤需要一定的样品浓度才能保证较高的反应效率和产物获得率。本专利技术通过在少量起始样品中加入含dUTP的λDNA,既可以减少样品在每步操作中的损失,又可以提高建库和免疫沉淀的效率,因此少量起始样品也可以在建库和MeDIP过程中采用常规的手动操作,实用性强。最为关键的是,USER酶可以特异性地降解含有dUTP的DNA,因此通过USER酶消化可以彻底去除MeDIP产物中的λDNA,避免了λDNA对样品测序文库的污染。本专利技术通过在来源较少的起始样品中补加含dUTP的λDNA,可以减少在建库和MeDIP过程中样品的损失,且能保证样品在建库过程中的接头连接效率和MeDIP过程中甲基化DNA的富集效率,将得到的MeDIP-DNA先用USER酶进行彻底消化以除去其中的λDNA,再进行PCR扩增、纯化,从而避免了λDNA出现在最终的测序文库中。因此,通过该方法最终可以实现对少量样品的MeDIP-seq分析。整个MeDIP过程采用常规的手动操作,不需要使用试剂盒和全自动样品处理系统。本技术除了可以应用于少量本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:第一步:制备U取代T的未甲基化λDNA,并对λDNA进行甲基化,得到甲基化λDNA;第二步:将未甲基化的λDNA加入待抽提DNA的样品中并提取基因组DNA,或者直接加入待测甲基化的基因组DNA样品中;第三步:超声断裂DNA片段,使片段长度为100‑500bp;第四步:将超声断裂后的DNA片段进行末端修复、3’端加dA和接头连接,得到连接产物,纯化连接产物;第五步:将纯化后的连接产物分为Input‑DNA和待分析DNA,在所述待分析DNA中加入甲基化λDNA,变性成单链DNA后通过抗体富集含甲基化DNA片段;第六步:将Input‑DNA和富集后DNA片段分别使用USER酶进行消化,随后分别进行PCR扩增、纯化并回收片段大小为100‑500bp的样品,得到高通量测序文库;第七步:对高通量测序文库进行定量后进行高通量测序和分析。

【技术特征摘要】
1.一种少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:第一步:制备U取代T的未甲基化λDNA,并对λDNA进行甲基化,得到甲基化λDNA;第二步:将未甲基化的λDNA加入待抽提DNA的样品中并提取基因组DNA,或者直接加入待测甲基化的基因组DNA样品中;第三步:超声断裂DNA片段,使片段长度为100-500bp;第四步:将超声断裂后的DNA片段进行末端修复、3’端加dA和接头连接,得到连接产物,纯化连接产物;第五步:将纯化后的连接产物分为Input-DNA和待分析DNA,在所述待分析DNA中加入甲基化λDNA,变性成单链DNA后通过抗体富集含甲基化DNA片段;第六步:将Input-DNA和富集后DNA片段分别使用USER酶进行消化,随后分别进行PCR扩增、纯化并回收片段大小为100-500bp的样品,得到高通量测序文库;第七步:对高通量测序文库进行定量后进行高通量测序和分析。2.如权利要求1所述的少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,所述第一步中未甲基化λDNA是通过PCR制备的,所述甲基化λDNA是通过CpG甲基转移酶制备的。3.如权利要求1所述的少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,PCR扩增未甲基化λDNA的上游引物为:TGTGGGGTGAATATGGCAGT,下游引物为CGTCGATTTGGTGCCGTAAT。4.如权利要求1所述的少量样品全基因组DNA甲基化的检测方法,其特征在于,所述第二步中待...

【专利技术属性】
技术研发人员:康亚妮赵小东邵志峰胡丛霞
申请(专利权)人:上海交通大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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