基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法技术

本发明专利技术公开一种基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其包括以下步骤：(1)利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库；(2)从所述文库中捕获目标基因，并对捕获的目标基因进行测序，得到测序结果，其中所述目标基因为全基因组的一部分；(3)将所述测序结果与人类基因组比对，得到比对结果；(4)建立参考库，其中参考库中包括多种不同参考样本，且各参考样本分别包括多种不同基因，所述多种不同基因均具有对应的FPKM基因表达值；(5)基于所述参考库对所述比对结果进行筛选，然后计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，基于所述相关性进行组织溯源。

【技术实现步骤摘要】
基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法
本专利技术涉及基因分析领域，具体地涉及基于游离DNA的单链建库结合目标基因捕获技术进行组织溯源的方法。
技术介绍
随着液体活检及无创监控在临床上的需求越来越多，游离DNA(cfDNA:cell-freeDNA)在癌症中的研究显得越来越重要。众所周知，cfDNA存在于人体中的循环血浆、尿液及其它体液中(Cell-freenucleicacidsinplasma,serumandurine:anewtoolinmolecμlardiagnosis.Ann.Clin.Biochem.40,122-130)，并且在健康个体中，cfDNA被认为主要来源于造血系正常细胞的凋亡而其他组织对其的贡献非常小(Predominanthematopoieticoriginofcell-freeDNAinplasmaandserumaftersex-mismatchedbonemarrowtransplantation.Clin.Chem.48,421-427)。有研究表明cfDNA的片段分布与其特定的起源相对应-核小体对应的峰值为约147bp，染色体(核小体+接头组蛋白)为约167bp(NoninvasivediagnosisoffetalaneuploidybyshotgunsequencingDNAfrommaternalblood.Proc.Natl.Acad.Sci.USA105,16266–16271/MaternalplasmaDNAsequencingrevealsthegenome-widegeneticandmutationalprofileofthefetus.Sci.Transl.Med.2,61ra91)。因此可以推测在特定的生理条件或疾病过程的背景下，相比于典型的健康状态相当大比例的cfDNA可能来源于组织的不同分布。2015年，来自于华盛顿大学的JayShendure研究团队在CELL杂志上发表了基于二代测序技术的组织溯源的突破性研究成果，其通过对cfDNA进行全基因组深度测序，不仅在全基因组上定位了核小体图谱，而且展示了如何利用核小体图谱来推断在癌症的病理状态下cfDNA来源的细胞类型。但该方法需要通过对cfDNA进行全基因组的深度测序，对于单个样本需要大量的二代测序数据，不仅测序成本较高，而且对后续的数据分析的能力及资源也会有很高的要求，增加了数据分析成本。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种组织溯源的方法，其不需要对个体的cfDNA进行全基因组深度测序，只需要对特定基因进行目标捕获测序即可达到组织溯源的目的，不仅大幅度节省了测序数据量，降低了测序成本及后续分析的复杂度，并且提供了灵活的基因组合选择以满足特定个体的组织溯源的需求。具体地，本专利技术包括以下内容。一种基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其包括以下步骤：(1)利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库；(2)从所述文库中捕获目标基因，并对捕获的目标基因进行测序，得到测序结果，其中所述目标基因为全基因组的一部分；(3)将所述测序结果与人类基因组比对，得到比对结果；(4)建立参考库，其中参考库中包括多种不同参考样本，且各参考样本分别包括多种不同基因，所述多种不同基因均具有对应的FPKM基因表达值；(5)基于所述参考库对所述比对结果进行筛选，然后计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，基于所述相关性进行组织溯源。在某些实施方案中，所述步骤(1)包括：前处理步骤：将游离DNA进行去磷酸化，然后在80-100℃范围温度下处理，得到处理后的游离DNA；第一连接步骤：将所述处理后的游离DNA与所述单链接头进行第一连接，得到第一连接产物；第二连接步骤：以所述第一连接产物为模板进行延伸得到延伸产物，然后，将所述延伸产物与所述双链接头进行第二连接，得到第二连接产物，扩增步骤：以第二连接产物为模板进行扩增，并回收扩增产物得到文库。在某些实施方案中，其中所述前处理步骤包括使游离DNA在DNA连结酶、DNA聚合酶和磷酸酶的复合酶作用下进行去磷酸化。在某些实施方案中，所述单链接头为3’末端接头，所述双链接头为5’末端接头。在某些实施方案中，所述步骤(2)包括：选取目标基因，以使目标基因不包括基因间序列，针对选取的目标基因制定捕获探针，利用捕获探针从所述文库中捕获目标基因。在某些实施方案中，所述步骤(2)中的测序为二代基因测序。在某些实施方案中，所述目标基因选自全基因序列和/或全外显子序列。在某些实施方案中，所述步骤(3)还包括在将所述测序结果与人类基因组比对之前，对原始数据去接头序列及低质量序列，并且保留测序序列读长至少35bp的步骤。在某些实施方案中，所述步骤(4)中的参考样本包括44个人类细胞系及32个原发组织，且所述多种不同基因至少为10000种。在某些实施方案中，所述步骤(5)包括计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，并根据相关性大小进行排序，选择相关性最大的前三种作为组织溯源结果。附图说明图1为Sample1的cfDNA片段长度分布统计图。图2为Sample2的cfDNA片段长度分布统计图。图3为Ref的cfDNA片段长度分布统计图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。本专利技术提供一种基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其为基于游离DNA(cell-freeDNA)的单链建库结合目标基因捕获技术进行组织溯源的方法。具体地，本专利技术包括以下步骤：(1)利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库；(2)从所述文库中捕获目标基因，并对捕获的目标基因进行测序，得到测序结果，其中所述目标基因为全基因组的一部分；(3)将所述测序结果与人类基因组比对，得到比对结果；(4)建立参考库，其中参考库中包括多种不同参考样本，且各参考样本分别包括多种不同基因，所述多种不同基因均具有对应的FPKM基因表达值；(5)基于所述参考库对所述比对结果进行筛选，然后计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，基于所述相关性进行组织溯源。下面详细说明本专利技术的方法。步骤(1):步骤(1)为文库构建步骤，其为利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库。利用传统方法构建得到的文库很容易丢失含量很少的游离DNA信息，特别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其包括以下步骤：(1)利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库；(2)从所述文库中捕获目标基因，并对捕获的目标基因进行测序，得到测序结果，其中所述目标基因为全基因组的一部分；(3)将所述测序结果与人类基因组比对，得到比对结果；(4)建立参考库，其中参考库中包括多种不同参考样本，且各参考样本分别包括多种不同基因，所述多种不同基因均具有对应的FPKM基因表达值；(5)基于所述参考库对所述比对结果进行筛选，然后计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，基于所述相关性进行组织溯源。

【技术特征摘要】
1.一种基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其包括以下步骤：(1)利用单链接头和双链接头由游离DNA构建文库；(2)从所述文库中捕获目标基因，并对捕获的目标基因进行测序，得到测序结果，其中所述目标基因为全基因组的一部分；(3)将所述测序结果与人类基因组比对，得到比对结果；(4)建立参考库，其中参考库中包括多种不同参考样本，且各参考样本分别包括多种不同基因，所述多种不同基因均具有对应的FPKM基因表达值；(5)基于所述参考库对所述比对结果进行筛选，然后计算筛选出的结果与FPKM基因表达值的相关性，基于所述相关性进行组织溯源。2.根据权利要求1所述的基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其中所述步骤(1)包括：前处理步骤：将游离DNA进行去磷酸化，然后在80-100℃范围温度下处理，得到处理后的游离DNA；第一连接步骤：将所述处理后的游离DNA与所述单链接头进行第一连接，得到第一连接产物；第二连接步骤：以所述第一连接产物为模板进行延伸得到延伸产物，然后，将所述延伸产物与所述双链接头进行第二连接，得到第二连接产物，扩增步骤：以第二连接产物为模板进行扩增，并回收扩增产物得到文库。3.根据权利要求2所述的基于游离DNA的目标基因捕获技术进行组织溯源的方法，其中所述前处理步骤包括使游离DNA在DNA连结酶、DNA聚合酶和磷酸酶的复合酶作用下进行去磷酸化。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：郎继东，田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11