用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用制造技术

技术编号:19448261 阅读:77 留言:0更新日期:2018-11-14 17:13
本发明专利技术公开了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用。其中该试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组,所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物,其中,所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物,以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、‑‑SEA、‑‑THAI,以及β缺失型SEA‑HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。利用该试剂盒能够同时检测地贫缺失型与突变型,具体地能够同时检测常见的7种缺失型与超过300种突变类型,并可以发现新的突变类型,且成本低廉,相对于现有地贫检测试剂盒优势显著。

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测
,具体而言,涉及一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒及其应用。
技术介绍
地中海贫血(在本文中有时简称“地贫”)是一种常见的溶血性单基因遗传病,多发于中东、中亚、非洲、东南亚和中国南方等地区。导致地贫的分子机理是:珠蛋白基因发生缺陷使其编码的肽链一种或几种合成减少或缺失,致使血红蛋白的组成成分比例失衡,进而导致血红蛋白不稳定。根据缺陷的珠蛋白基因种类不同,地贫主要分为α地贫和β地贫。α地贫是由于α珠蛋白基因的缺失或者突变导致α珠蛋白肽链合成受到抑制而引起的溶血性贫血疾病。α珠蛋白基因簇位于16p13.3,每条染色体各有2个α珠蛋白基因,一对染色体共有4个α珠蛋白基因。α珠蛋白基因的缺失或突变是产生α地贫的最常见原因,α地贫主要包括缺失型和非缺失型。β地贫是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白肽链缺陷或合成不足而引起的遗传性溶血性贫血疾病。β珠蛋白基因位于β珠蛋白基因簇,该基因簇定位于染色体11p15,β地贫的分子病理具有高度异质性,主要为β珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。地贫患者长期贫血会导致脏器功能减退、导致心功能衰竭、肝脾肿大等,影响患者的生长发育,目前国内外尚无有效的治疗方法,只能通过定期输血等方法维持生命,给患者自身及家庭和社会带来沉重的负担。因而,控制地贫,预防是关键,通过对地贫高发人群的地贫筛查和婚育指导可有效降低重型地贫的发生率。目前地贫有多种筛查方法,但基因检测是诊断地贫的金标准,基因检测能够大大提高地贫检测的准确性,减少地贫的漏检率,这对地贫的诊治和预防有重要意义。然而,据珠蛋白数据库统计,全球已发现地贫类型超过400种,我国常规检测23-27种的地贫检测技术存在约2%-5%的漏检。因而,目前用于地贫基因检测的方法和试剂盒仍有待改进。
技术实现思路
首先,需要说明的是,本专利技术是基于专利技术人的下列发现和工作而完成的:专利技术人针对目前的地贫基因检测方法和试剂盒进行了一系列的理论研究和实验探索,结果发现:目前地贫分子诊断的方法有很多,利用高通量测序技术检测地贫突变型的方法亦有报道。这些地贫常用基因检测方法及其优缺点如下表所示:目前市售的地贫检测试剂盒主要有下列3种:(1)中山大学达安基因股份有限公司的“地中海贫血(α/β型)基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法)”,用于定性检测全血样本中的α-珠蛋白基因3种缺失(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种突变(WS122、QS125和CS142)及β-珠蛋白基因17种突变(CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-1-1、IVS-1-5、CD31和Cap);(2)亚能生物技术(深圳)有限公司的“地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”,用于体外定性检测人全血基因组DNA样本,能够检出中国人常见的3种缺失型α-地中海贫血基因突变(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种非缺失型α-地中海贫血基因突变(αConstantSpringα(αCSα)、αQuongSzeα(αQSα)和αWestmeadα(αWSα))和17种β-地中海贫血基因突变(41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM);(3)深圳益生堂生物企业有限公司的“β地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)”与“α-地中海贫血基因检测试剂盒(Gap-PCR法)”、“非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)”,分别用于定性检测人基因组DNA中的17种β珠蛋白基因突变和定性检测抗凝外周血样本中的东南亚型缺失(--SEA/)、左侧缺失(-α4.2/)、右侧缺失(-α3.7/)和泰国型缺失(--THAI/)4种α-地中海贫血基因缺失型,以及常见的3种α-地中海贫血基因突变型(CS、QS、WS)。综上,专利技术人发现:各种地贫基因检测方法均有不同程度的缺点,例如,Gap-PCR方法只能检测缺失型;各种突变型的检测方法中,PCR-ARMS可检测突变的种类少,PCR-ASO、PCR-RDB和RealtimePCR方法虽然检测成本低,能够快速检测多种突变类型,但仅能针对常见热点突变进行检测(例如检测国内15-20种突变类型),无法检测其他罕见突变型及新突变,存在一定的漏检率。而PCR-sequencing方法不仅可以检测多种突变类型,还可以发现新的突变类型,在检测结果方面不失为最优选择,但也同样存在成本高的缺点。而上述现阶段的市售各试剂盒可检测的突变类型少,针对β缺失型突变的检测能力不足,且无法检测罕见的异常血红蛋白突变与各种新发突变。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本专利技术的一个目的在于提供一种检测范围除涵盖上述所有试剂盒的检测类型外,在突变型检测方面还可检测出较为罕见的异常血红蛋白突变与各种新发突变,在缺失型检测方面还可检测出β缺失型的试剂盒,即同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒,以及相应的检测方法。进而,在本专利技术的第一方面,本专利技术提供了一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒。根据本专利技术的实施例,所述试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组,其中所述多个包括1个的情形,所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物,其中,所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物,以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI,以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。根据本专利技术的实施例,利用本专利技术的试剂盒能够有效地扩增地中海贫血基因相关片段,进而结合建库和高通量测序技术后,即可有效检测地中海贫血基因,并且能够同时检测地贫缺失型与突变型。具体地,本专利技术的试剂盒能够同时检测常见的7种缺失型与超过300种突变类型,并可以发现新的突变类型,且成本低廉,相对于突变类型检测范围小、缺失型检测能力缺乏的现有地贫检测试剂盒,优势显著。其中,需要说明的是,所述扩增引物组是专利技术人通过一系列精巧构思和科学的实验设计、探索筛选而最终获得的。由于地贫基因突变情况复杂,既有大片段的基因缺失和重复,又有序列相似程度很高的假基因和同源基因;同时要兼顾第二代测序技术读长较短的因素,这给引物设计造成了极大的困难。进而,专利技术人针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因分别设计PCR引物。首先,设计突变型的引物:对HBA1、HBA2、HBB基因(分别为两个α珠蛋白基因和一个β珠蛋白基因)序列进行生物信息学分析,并将HBA基因序列相似度很高的假基因ψα1,ψα2以及β珠蛋白基因簇中的其他基因列入生物信息学分析范围,找出HBA1、HBA2、HBB基因的保守和特异序列,然后设计引物;将设计得到的引物序列进行全基因组比对(blast)分析,除精确比对到目标HBA1、HBA2、HBB基因外,在基因组的其它位置无精确比对的引物做为候选引物,然后本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组,其中所述多个包括1个的情形,所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物,其中,所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物,以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、‑‑SEA、‑‑THAI,以及β缺失型SEA‑HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含多个用于扩增地中海贫血基因的扩增引物组,其中所述多个包括1个的情形,所述扩增引物组包括针对α珠蛋白基因和β珠蛋白基因设计的引物,其中,所述扩增引物组包括针对HBA1基因、HBA2基因、HBB基因的突变型检测引物,以及针对α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI,以及β缺失型SEA-HPFH、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述扩增引物组的引物序列如SEQIDNO:1-27所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,在所述试剂盒中,SEQIDNO:1-27所示的引物被分为如下所示的5个引物组:,其中,5个引物组分开放置,而针对每个引物组,其引物混合放置。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒,其特征在于,在所述试剂盒中,所述扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列,且在每个扩增引物组内,引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同,并与引物组2的引物标签序列不同,而所述多个扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同,任选地,所述引物标签序列的长度为5-10bp,优选7bp,任选地,针对每个扩增引物组,引物组1、引物组3、引物组4和引物组5携带相同的引物标签序列,且所述引物标签序列为选自下列的任意之一:任选地,针对每个扩增引物组,引物组2的引物标签序列为选自下列的任意之一:5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,每个扩增引物组中各引物的重量份数如下表所示:6.一种用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒中的多个扩增引物组,分别对多个待测样本进行PCR扩增,以便获得多个待测样本的PCR产物,其中,各扩增引物组的每条引物的5’端均添加有引物标签序列,且在每个扩增引物组内,引物组1、引物组3、引物组4和引物组5的引物标签序列相同,并与引物组2的引物标签序列不同,而各扩增引物组之间的所有引物标签序列相互不同,以便使所述多个待测样本的PCR产物的引物标签序列相互不同;以及将所述多个待测样本的PCR产物混合,以便获得所述用于同时检测地中海贫血基因突变型与缺失型的测序文库,任选地,将所述多个待测样本的PCR产物混合后进一步包括:混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接、片段筛选的步骤,任选地,在所述多个待测样本的PCR产物混合之后,以及混合PCR产物打断、末端修复、加“A”、接头连接和片段筛选的至少一个步骤之后进一步包括对产物进行纯化的步骤,任选地,所述接头为标签...

【专利技术属性】
技术研发人员:张彩芬杨晓琴方俊彬周梅珍陈仕平陈文景柴相花刘碧湘张礼茗黄晓燕褚仲杰李映霞梁碧珊严红梁英敏程征宇林佳张红云李云宋海峰
申请(专利权)人:华大生物科技武汉有限公司深圳华大临床检验中心
类型:发明
国别省市:湖北,42

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