一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物制备技术领域，特别涉及一种RXRα蛋白稳定高表达的RXRα基因稳定转染细胞系及其制备方法。所述细胞系为RXRα基因随机整合至SK‑N‑SH细胞染色体的细胞克隆，细胞系基因型稳定，可随细胞增殖稳定遗传，子代细胞内稳定高表达RXRα蛋白，大大提升了RXRα蛋白高表达的稳定性，以保证RXRα基因功能性和受试材料的可靠性。本发明专利技术提供了一种所述细胞系的制备方法，设计制备真核表达载体，经细胞核转染技术以真核表达载体转染SK‑N‑SH细胞，经G418药物筛选得到RXRα基因稳定转染成功的细胞克隆，PCR、基因测序鉴定其是否为RXRα基因稳定转染阳性的细胞克隆，采用Westernblot技术鉴定阳性克隆细胞内RXRα蛋白表达水平，从而得到基因型可稳定传代的RXRα蛋白稳定高表达细胞系。

【技术实现步骤摘要】
一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法
本专利技术属于生物制备
，特别涉及一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法。
技术介绍
RXR(HomosapiensretinoidXreceptor，人类视黄醇X受体)基因的mRNA主要有三种剪接体，分别为RXRα(NM_002957.5)，RXRβ(NM_001291920.1)，RXRγ(NM_001291921.1)。细胞内RXRα受体可与多种药物相结合，与人类多数疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎密切相关。构建RXRα蛋白高表达与低表达细胞系，将有利于研究RXRα受体功能，并有助于探讨与RXRα受体相关疾病的发病机理以及开发针对疾病靶点的有效药物。细胞转染技术是将外源遗传物质导入目的细胞，使其在目的细胞内表达，获得新的遗传标志的过程，是基因表达与基因功能研究的常用技术。细胞转染可分为两大类，一类是瞬时转染，另一类是稳定转染。前者外源遗传物质不整合到宿主染色体，细胞中存在多个外源基因拷贝数，产生高水平的表达，该表达通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。稳定转染可通过核转技术将外源目的基因整合到细胞染色体，成为细胞基因组的一部分，使目的基因在细胞内稳定表达，稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。基因整合到染色体的概率很小，需要选择性标记基因(抗生素抗性基因)对转染细胞进行筛选。将目的基因与抗生素抗性基因连接共转染目的细胞，随后采用相应的抗生素对转染后的细胞进行筛选。只有稳定转染的细胞才会获得对抗生素的抗性，在长期培养中存活下来，由此实现对目标细胞的筛选和扩增，得到稳定转染的同源细胞系。诸如前述，有效的构建一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系对于RXRα蛋白在生物体内的生物学效应的研究及其相关疾病的药物的开发至关重要，本专利技术拟解决这一问题。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的首要目的在于提供一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系，其特征在于，该细胞系分别为RXR/TG-SK-N-SH-97#、RXR/TG-SK-N-SH-202#，所述细胞系通过以下制备方法制备得到。本专利技术的另一目的在于提供一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系的制备方法：(1)制备RXRα高表达的真核表达载体，该载体包含有CMV启动子、pcDNA3.1序列、EGFP示踪基因以及目的基因RXRα，终载体为pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体；(2)将终载体通过核转的方式将目的基因插入人神经母细胞瘤的永生化细胞SK-N-SH细胞，采用G418药物筛选得到稳定的细胞克隆；(3)筛选得到的细胞克隆采用PCR扩增RXRα特异性序列，经琼脂糖凝胶电泳初步挑选转基因阳性细胞克隆，将疑似阳性克隆细胞送检核心序列；(4)采用qPCR、Westernblot检测技术鉴定核心序列测序无误的阳性克隆细胞RXRα基因mRNA及蛋白表达水平，最终得到RXRα蛋白稳定高表达的细胞系。进一步的优选方案为，所述制备方法包括以下制备步骤：(1)构建真核表达载体：(1.1)引物设计；(1.2)EGFP-PA片段获取；(1.3)pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切获得载体骨架；(1.4)将EGFP-PA片段与pcDNA3.1骨架连接成pcDNA3.1-EGFP；(1.5)RXRα片段获取；(1.6)pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切获得载体骨架；(1.7)RXRα-2A扩增产物Infusion连接pcDNA3.1-EGFP骨架获得pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP；(1.8)酶切验证pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒是否构建成功；(2)、细胞转染；(3)、阳性细胞筛选及克隆培养；(4)、阳性克隆细胞的鉴定：(4.1)真核表达载体阳性克隆鉴定；(4.2)阳性克隆RXRαmRNA表达水平鉴定；(4.3)阳性克隆细胞RXRα蛋白高表达水平鉴定。本专利技术相对于现有技术的技术效果包括：(1)本专利技术有效的构建一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系该细胞系，RXRα高表达型97号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-97#)和202号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-202#)RXRα蛋白的相对表达量与野生型(SK-N-SH)细胞组比，RXR/TG-SK-N-SH-97#和RXR/TG-SK-N-SH-202#的RXRα蛋白表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。其中，RXR/TG-SK-N-SH-97#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.87倍(P<0.01)，RXR/TG-SK-N-SH-202#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.90倍(P<0.01)。(2)该细胞系基因型稳定，可稳定高表达RXRα，不需要定期进行药物筛选与蛋白表达水平鉴定，从而大大提高了RXRα蛋白相关功能研究实验受试材料的可靠性与研究效率，降低RXRα蛋白高表达细胞增殖培养难度。(3)该制备方法简化了细胞构建的程序，重现性好，利于产业化应用。附图说明图1EGFP-SV40polyA扩增产物示意图。图2pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切产物示意图。图3EGFP+SV40polyA扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果示意图。图4pcDNA3.1-EGFP的中间载体图谱。图5pcDNA3.1-EGFP双酶切验证示意图。图6RXRα-2A扩增产物示意图。图7pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切产物示意图。图8infusion连接反应体系与反应程序示意图。图9RXRα-2A扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果。图10pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体终载体质粒图谱。图11pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒酶切验证示意图。图12SK-N-SH野生型细胞形态示意图。图13核转前细胞形态示意图。图14转染后细胞EGFP荧光蛋白表达示意图。图15细胞克隆形成过程与细胞克隆的形态。图16挑取的细胞克隆PCR鉴定结果图。图17疑似阳性克隆细胞RNA琼脂糖凝胶电泳图。图18qPCR三步法扩增程序示意图。图19qPCR扩增曲线示意图。图20疑似阳性细胞克隆细胞内RXRαmRNA相对表达量数据分析结果示意图。图21RXRα蛋白在SK-N-SH野生型与RXRα基因高表达型细胞中的表达鉴定示意图。图22RXRα蛋白在SK-N-SH野生型与RXRα基因高表达型细胞中的相对表达量测定示意图。注：SK-N-SH为野生型细胞；RXR/TG-SK-N-SH-97#RXRα基因高表达型97号细胞；RXR/TG-SK-N-SH-202#为RXRα基因高表达型202号细胞。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细的描述，但专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法，(1)制备pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体(1.1)引物设计：设计引物从EGFP-N1载体质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段；设计引物从SK-N-SH细胞cDNA扩增RXRα的CDS序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系的制备方法，其特征在于，(1)制备RXRα基因高表达的真核表达载体，该载体包含有CMV启动子、pcDNA3.1序列、EGFP示踪基因以及目的基因RXRα，终载体为pcDNA3.1‑RX Rα‑2A‑EGFP真核表达载体；(2)将终载体通过核转的方式将目的基因插入人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK‑N‑SH细胞，采用G418药物筛选得到稳定的细胞克隆；(3)筛选得到的细胞克隆，采用PCR扩增RXRα特异性序列，经琼脂糖凝胶电泳初步挑选转基因阳性细胞克隆，将疑似阳性的细胞克隆送检，检测核心序列；(4)采用qPCR、Western blot检测技术鉴定核心序列测序无误的阳性克隆细胞mRNA及蛋白表达水平，最终得到RXRα蛋白稳定高表达的细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系的制备方法，其特征在于，(1)制备RXRα基因高表达的真核表达载体，该载体包含有CMV启动子、pcDNA3.1序列、EGFP示踪基因以及目的基因RXRα，终载体为pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体；(2)将终载体通过核转的方式将目的基因插入人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK-N-SH细胞，采用G418药物筛选得到稳定的细胞克隆；(3)筛选得到的细胞克隆，采用PCR扩增RXRα特异性序列，经琼脂糖凝胶电泳初步挑选转基因阳性细胞克隆，将疑似阳性的细胞克隆送检，检测核心序列；(4)采用qPCR、Westernblot检测技术鉴定核心序列测序无误的阳性克隆细胞mRNA及蛋白表达水平，最终得到RXRα蛋白稳定高表达的细胞系。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：(1)构建真核表达载体：(1.1)引物设计；(1.2)EGFP-PA片段获取；(1.3)pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切获得载体骨架；(1.4)将EGFP-PA片段与pcDNA3.1骨架连接成pcDNA3.1-EGFP；(1.5)RXRα片段获取；(1.6)pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切获得载体骨架；(1.7)RXRα-2A扩增产物Infusion连接pcDNA3.1-EGFP骨架获得pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP；(1.8)酶切验证pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒是否构建成功；(2)细胞转染；(3)阳性细胞筛选及克隆培养；(4)阳性克隆细胞的鉴定：(4.1)真核表达载体阳性克隆鉴定；(4.2)阳性克隆RXRαmRNA表达水平鉴定；(4.3)阳性克隆细胞RXRα蛋白表达水平鉴定。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.1)为设计引物从EGFP-N1载体质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段；设计引物从SK-N-SH细胞cDNA扩增RXRα的CDS序列，设计时需要去掉终止密码子TAG，以扩增目的基因RXRα并在后端添加2A序列及IN-Fusion连接所需的约15bp的载体骨架片段；所述步骤(1.2)为采用PCR扩增技术从EGFP-N1质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段；反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1min)×35cycles；所述步骤(1.3)为采用内切酶BamHI酶切获取骨架片段pcDNA3.1(+)，BamHI酶切反应体系酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定线性化pcDNA3.1(+)片段大小，切胶回收获取酶切骨架片段，反应程序：37℃，3h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.4)为纯化EGFP-PA片段扩增产物，Infusion连接(In-FusionHDCloningKits,Clontech)，转化，涂板，挑菌，菌液PCR，结果如图3，挑选两个阳性菌落扩大摇菌，保菌，提质粒；连接和转化步骤如下：a)连接为冰上加样：5μlIn-Fusion+1.5μl载体骨架+2.5μlPCR产物+1μl水，16℃反应2h或4℃过夜，取出后冰上放置；b)取感受态细胞，置于冰上溶解，并用移液枪轻轻吹打混匀感受态细胞；c)取1.5ml离心管，加入5μl载体连接产物，加入50μl感受态细胞，轻轻混匀，并马上置于冰上；d)冰上孵育30min，42℃水浴锅中热激90s，马上置于冰上冷却1～2min；e)加上150μl无抗LB培养基，37℃摇床200rpm活化1h，同时取相应数量的Amp抗性平板于烘箱中预热；f)取活化后的菌液30-50μl于预热的Amp抗性平板中，均匀凃布，正向放置2～3min后倒置于37℃培养箱培养过夜；挑克隆菌液PCR步骤如下：a)观察平板上的菌落形态，肉眼可见且能和其他菌落区分开时即可挑克隆；b)超净工作台中，取相应数量的1.5ml无菌离心管于试管架上，标号后每个离心管中加入6μl抗性培养基，待用；c)用移液枪小心的从平板中挑取较大的菌落，并在有6μl培养基的离心管中吹打混匀(对于克隆长得较小的菌落，可挑出来混匀后置摇床中摇1h后再PCR鉴定)；d)取1μl上述菌液用于PCR鉴定，剩余5μl菌液置于37℃烘箱或摇床；PCR鉴定结果出来后，选出阳性菌株，送检测序。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.5)为:RXRα片段扩增的反应体系如下表：反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1.5min)×35cycles，琼脂糖凝胶电泳切胶回收RXRα-2A片段；所述步骤(1.6)为:将pcDNA3.1-EGFP(infusion连接EGFP时同源序列将BamBI酶切位点补齐)用限制性内切酶BamHI酶切，反应体系如下表；反应程序为：37℃，3h，琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切骨架片段；所述步骤(1.7)为:纯化RXRα-2A扩增产物与pcDNA3.1-EGFP单酶切骨架片段，两片段经Infusion连接，转化，涂板，挑菌，做菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建清，李云秀，蒋友胜，吴东亭，彭金铃，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心深圳市卫生检验中心，深圳市预防医学研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44