一种用于检测HIV-1的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测HIV‑1的试剂盒，其包括扩增试剂；扩增试剂原料包括：HIV‑1引物探针序列；保护剂，其包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；灵敏度增强剂，其包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX‑100；扩增酶系，其包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；dNTPS。本发明专利技术可将核酸的提取和扩增检测在全封闭环境下一体化整合，高效简便，结果准确。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HIV-1的试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测HIV-1的试剂盒。
技术介绍
以RPA恒温扩增技术为核心，将核酸自动提取过程与RPA恒温扩增检测过程，构建成为一体化的核酸提取与扩增检测系统，对于进一步提高核酸诊断分析效率，实现整个核酸诊断分析过程的自动化具有重要的现实意义。中国专利200880122734.X公开了一种检测HIV抗原用试剂,其含有第一抗体、固相和第二抗体,其中第一抗体是用标记物标记了的识别HIV-1p24抗原的第一人单克隆抗体,第二抗体是与可结合到上述固相上的物质结合的识别HIV-1p24抗原的第二人单克隆抗体。中国专利201510494301.9公开了一种人类免疫缺陷病毒HIV-1的定量检测试剂盒，包括：样本处理剂，包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K；用于靶核苷酸扩增的上游引物HIV-F；用于靶核苷酸扩增的下游引物HIV-R；用于靶核苷酸检测的Taqman探针HIV-P，Taqman探针HIV-P的两端分别结合有荧光基团和荧光猝灭剂；以及RNA一步法反应缓冲液。中国专利申请201510292408.5公开了一种HIV-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用。本专利技术的试剂盒包括检测待测HIV-1基因组的基因型和耐药突变位点的成套引物；所述成套引物包括扩增引物对和测序引物组。上述技术方案的缺陷在于：检测过程繁琐，多个环节需要增加手工操作；检测时间长；扩增试剂效率不高、灵敏度低、保存条件苛刻；检测过程开放，容易引起外部环境与检测试剂交叉污染。因此，如何提供一种检测过程简便，检测时间短；扩增试剂高效灵敏、便于保存；检测过程封闭、可有效避免外部环境与检测试剂交叉污染的试剂盒成为了业界需要解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种用于检测HIV-1的试剂盒，其检测过程简便，检测时间短；扩增试剂高效灵敏、便于保存；检测过程封闭、可有效避免外部环境与检测试剂交叉污染。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，试剂盒包括扩增试剂；扩增试剂原料包括：HIV-1引物探针序列；保护剂，保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；灵敏度增强剂，灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX-100；扩增酶系，扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；dNTPS。本专利技术中，扩增试剂原料各组分混合在一起，呈液态；经过冻干工艺处理后得到干粉状的扩增试剂。本专利技术中，HIV-1引物探针序列包括：上游引物HIV-1F5’-TGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGG-3’；下游引物HIV-1R5’-CCCGAAAATTTTGAATTTTTGTAATTTGTTTTTG-3’；探针HIV-1P5’-TGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCCC[SIMA/FAM]GC[THF]C[dT-BHQ1]GTACCCCCCAATCCCC-3’；内标上游引物NBF5’-CGGCGGTCACCAGGCTGCGATGCAGAT-3’；内标下游引物NBR5’-GCTTGTTGTACCAGCAATATCGCTACG-3’；内标探针NBPTCAAGCAGCCATGCAAATGTTAA(dT-HEX)A(dSpacer)A(dT-BHQ)GAGACTATTAACGAAGA。本专利技术中，保护剂中各组分在扩增试剂原料中的质量分数分别为海藻糖10％、蔗糖5％和棉子糖2％。本专利技术中，灵敏度增强剂中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为苏氨酸1M、牛血清白蛋白0.1M和TrisX-1000.5M。本专利技术中，扩增酶系中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为重组酶50ng/μl、辅助酶30ng/μl、单键结合蛋白200ng/μl、聚合酶10ng/μl、内切酶10ng/μl。本专利技术中，dNTPS在扩增试剂原料中的浓度为15mM；dNTPS为脱氧核糖核苷酸，可为扩增反应提供原料。本专利技术中，扩增试剂原料进一步包括逆转录酶，其用量为3U。本专利技术解决了核酸提取和核酸扩增检测不能一体化、核酸提取和核酸扩增检测过程操作繁杂的技术问题，高效简便，结果准确。根据本专利技术另一具体实施方式，扩增试剂原料进一步包括反应平台，反应平台包括缓冲系统和供能系统；缓冲系统包括Tris-SO4(PH8.0)、KCl和MgCl2；供能系统包括ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。本方案中，Tris-SO4为硫酸盐缓冲液，可使pH值稳定在8.0，这是扩增酶系的最佳反应条件。缓冲系统中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为Tris-SO4100mM、KCl100mM和MgCl250mM。供能系统可为扩增反应提供能量，其各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为ATP10mM、磷酸肌酸100mM和肌酸激酶8mM；ATP为腺嘌呤核苷三磷酸。根据本专利技术另一具体实施方式，扩增试剂原料进一步包括聚乙二醇；聚乙二醇在扩增试剂原料中的浓度为10％，优选为PEG-8000。本方案中，聚乙二醇具有较高黏度，可在扩增反应时将参与反应的各物质限定在较小区域，缩短反应距离，加强反应效果。根据本专利技术另一具体实施方式，扩增试剂原料通过冻干工艺处理，得到扩增试剂：冻干工艺包括：步骤S1：将扩增试剂原料在-55℃环境下放置6h；步骤S2：将扩增试剂原料在-35℃环境下放置12h；步骤S3：将扩增试剂原料在-25℃环境下放置4h；步骤S4：将扩增试剂原料在20℃环境下放置6h。本方案中，扩增试剂需保存于4℃环境中。保护剂可使扩增试剂原料中其他组分在冻干过程中不受破坏，保证扩增反应顺利进行。灵敏度增强剂可使加强扩增试剂的灵敏度，使之可以检测更低浓度的样本。经冻干工艺制得的扩增试剂呈干粉状，易于保存，使用方便，。采用冻干工艺将液体试剂冻干成干粉，主要是为了解决液体试剂长期在-20℃保存，会出现扩增效率下降、灵敏度低等问题；液体试剂一般都会在-20℃保存，高于-20℃液体试剂的酶系很容易失去活性，保存条件较高；干粉试剂可在4℃保存较长时间，十分方便。根据本专利技术另一具体实施方式，试剂盒包括：提取仓，提取仓包括按照样本流向依次分布的裂解机构、洗涤机构和洗脱机构；裂解机构内设有裂解试剂和磁性物质；洗涤机构包括第一油槽和洗涤槽，洗涤槽内设有洗涤液；第一油槽位于裂解机构和洗涤槽之间；洗脱机构包括第二油槽和洗脱槽，洗脱槽内设有洗脱液；第二油槽位于洗涤槽和洗脱槽之间；第一油槽和第二油槽内均设有油相；相邻两槽之间设有可活动的隔断；裂解机构与第一油槽之间设有可活动的隔断；驱动机构，驱动机构包括可按照样本流向滑移的滑块；滑块上设有磁铁；扩增管，扩增管位于洗脱机构下游；扩增管与洗脱槽连通。本方案中，提取仓可以由弹性材料制成。提取仓中，槽的数量根据所承载试剂或固体物质所需而定，容量可不尽相同。磁铁位于滑块中心，其为永磁铁或电磁铁；磁性物质可为磁珠。驱动机构进一步包括用于驱动滑块运行的动力部件，动力部件可为电机或气缸。样本裂解后产生的核酸附着在磁性物质上；滑块运动时，通过磁铁带动磁性物质运动，从而带动核酸运动。各槽沿直线分布；在使用过程中，提取仓可以水平放置、竖直放置或者倾斜放置。当滑块经过隔断时，驱动机构会使隔断失效，隔断两侧的槽相通；部分隔断永久失效，部分隔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测HIV‑1的试剂盒，其中，所述试剂盒包括扩增试剂；所述扩增试剂原料包括：HIV‑1引物探针序列；保护剂，所述保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；灵敏度增强剂，所述灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX‑100；扩增酶系，所述扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；dNTPS。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HIV-1的试剂盒，其中，所述试剂盒包括扩增试剂；所述扩增试剂原料包括：HIV-1引物探针序列；保护剂，所述保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；灵敏度增强剂，所述灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX-100；扩增酶系，所述扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；dNTPS。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料进一步包括反应平台，所述反应平台包括缓冲系统和供能系统；所述缓冲系统包括Tris-SO4(PH8.0)、KCl和MgCl2；所述供能系统包括ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料进一步包括聚乙二醇。4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料通过冻干工艺处理，得到所述扩增试剂：所述冻干工艺包括：步骤S1：将所述扩增试剂原料在-55℃环境下放置6h；步骤S2：将所述扩增试剂原料在-35℃环境下放置12h；步骤S3：将所述扩增试剂原料在-25℃环境下放置4h；步骤S4：将所述扩增试剂原料在20℃环境下放置6h。5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：提取仓，所述提取仓包括按照样本流向依次分布的裂解机构、洗涤机构和洗脱机构；所述裂解机构内设有裂解试剂和磁性物质；所述洗涤机构包括第一油槽和洗涤槽，所述洗涤槽内设有洗涤液；所述第一油槽位于所述裂解机构和所述洗涤槽之间；所述洗脱机构包括第二油槽和洗脱槽，所述洗脱槽内设有洗脱液；所述第二油槽位于所述洗涤槽和所述洗脱槽之间；所述第一油槽和所述第二油槽内均设有油相；相邻两槽之间设有可活动的隔断；所述裂解机构与所述第一油槽之间设有可活动的隔...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑园，陈华云，张天海，王盼盼，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44