利用糖基转移酶启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法技术

本发明专利技术涉及利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，利用木质部特异性表达的糖基转移酶8D1启动子驱动赤霉素氧化酶GA20ox基因过量表达改变杨树木材纳米纤维素特性；其中，通过获得在杨树茎秆木质部中特异表达的启动子8D1P驱动GA20ox基因过量表达的重组载体，并将所述重组载体用于杨树的遗传转化，得到8D1P:GA20ox转基因84K杨树，达到木材纳米纤维素特性改良的目的；所述转基因杨树的木材纳米纤维素特性改良体现为纳米纤维素直径增大、纳米纤维素的长径比增大。转基因材料纳米纤维素的纤维直径更大，能显著提高纤维的机械强度，上述特性变化可以更利于制浆造纸的应用。

【技术实现步骤摘要】
利用糖基转移酶启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法。
技术介绍
杨树是全世界广泛栽培的重要造林树种之一，具有分布广、生长快、无性繁殖能力强等特点，加之其速生丰产、遗传背景清楚等优势，已被广泛用作木本植物遗传研究的模式体系。我国杨树资源丰富，在最近几年，我国杨树造林面积不断扩大，已成为世界上人工林面积最大的国家。银腺杨无性系84K出苗期生长快、易于转化且木材材质好，如能改良杨树木材纳米纤维素的特性，将有利于制浆造纸中的应用。赤霉素通过影响细胞分裂来调控植物生长和发育，包括茎伸长和木材形成等，然而目前关于赤霉素的合成途径如何影响木材纳米纤维素的特性的研究比较欠缺。树木木材纤维细胞的长径比及纤维直径大小是影响制浆造纸的重要指标。赤霉素氧化酶基因GA20ox是赤霉素代谢途径的关键调控因子，利用基因工程技术调控杨树赤霉素合成途径，对木材纳米纤维素特性影响的研究目前尚处于探索阶段。前人在赤霉素合成基因对树木材性影响的相关研究较为有限，虽然对GA20ox的功能开展了一定的研究，发现对GA20ox过表达转基因杨树茎横切面显示出木射线大幅增加，木质部细胞宽度增加130％，可推测木质部增粗可能由于木质部分化促进，表明GA20ox表达增加可刺激形成层活动产生更多的木质部(Hyung-WooJeon等，2016)，初步说明了GA20ox在木材形成中的作用。但是，对于GA20ox基因如何影响木材组分结构没有研究。因此利用基因调控杨树赤霉素合成途径是一条培育纳米纤维素特性改良的杨树新品的可行且有效的技术途径，并有着广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，通过调控GA20ox表达改造杨树纳米纤维素特性，增大纳米纤维素直径，以便有利于制浆造纸应用。为实现上述目的，本专利技术提供了利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，包括利用木质部特异表达的糖基转移酶8D1启动子过量表达赤霉素氧化酶GA20ox基因改变杨树木材纳米纤维素特性。优选地，所述杨树为84K银腺杨(P.alba×P.glandulossa)。其中，通过获得在杨树茎秆木质部中特异表达的启动子8D1P，驱动GA20ox基因过量表达的重组载体，用于农杆菌介导的84K杨遗传转化，得到纳米纤维素特性改良的8D1P:GA20ox转基因84K杨树，以期达到木材纳米纤维素特性改良的目的；所述转基因杨树的木材纳米纤维素特性改良体现为纳米纤维素直径增大、纳米纤维素的长径比增大。优选地，过表达转基因植株相对于对照型植株的纳米纤维素直径增大1.5倍，纳米纤维素直径由对照组约40nm增加到约100nm。优选地，所述糖基转移酶8D1启动子通过在杨树木质部中特异性地过量表达GA20ox促进赤霉素(GA3，GA9)及异戊烯腺嘌呤(IP)的合成，影响杨树生长，并改良杨树木材纳米纤维素特性。本专利技术还提供了一种培育木材纳米纤维素特性改良的转基因杨树的方法，其包括：A、获得包括糖基转移酶8D1启动子和赤霉素氧化酶GA20ox基因的表达盒，并构建重组载体；B、将所述重组载体转入杨树，得到8D1P:GA20ox转基因杨树。优选地，培育木材纳米纤维素特性改良的转基因杨树的方法包括：A、获得含有8D1P:GA20ox基因表达盒的重组载体；B、选取生长状态良好的杨树叶片放入分化培养基中，在黑暗条件下进行预培养；C、将所述重组载体通过转化侵染转入所述杨树叶片中，得到8D1P:GA20ox转基因杨树植株。进一步，培育所述8D1P:GA20ox转基因杨树的步骤包括：A、取拟南芥茎干提取总RNA，并对拟南芥GA20ox基因的序列信息与特性进行分析，确定GA20ox基因的表达模式；B、构建GA20ox基因过表达载体，将GA20ox基因全长cDNA正向连接到pBI121-PtrGT8D1P载体中，测序正确后得到含有GA20ox基因的植物过表达载体；C、选取状态良好的84K杨叶片放入分化培养基中黑暗预培养3天，将GA20ox过表达载体转入农杆菌，制备成侵染液；D、采用用侵染液侵染84K杨叶片后放回原培养基中，在共培养3天后转至筛选培养基中，每15天换1次培养基，待可见芽出现，再把叶盘转至芽伸长培养基，待不定芽长至3cm左右时时转入生根培养基诱导生根，之后培养成壮苗，得到8D1P:GA20ox转基因84K杨树。基于上述技术方案，本专利技术的优点是：本专利技术的利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法通过利用木质部特异表达的糖基转移酶8D1(Glycosyltransferase8D1,GT8D1)基因启动子过量表达赤霉素氧化酶GA20ox基因调控杨树纤维细胞直径和长径比，是改善制浆造纸利用的有效途径之一。本专利技术通过获得茎秆木质部中特异表达的启动子(8D1P)，驱动GA20ox基因过量表达的重组载体。具体而言，通过农杆菌介导的84K杨树的遗传转化，得到8D1P:GA20ox转基因84K杨树。所述转基因植株相对对照纳米纤维素直径变大了1.5倍，其具有较大的应用价值。本专利技术利用的GT8D1基因的启动子是木质部表达特异启动子，可改良树木纳米纤维素特性，增加纤维细胞的直径，为解决制浆造纸力学应用的提供思路。本专利技术从拟南芥中克隆得到的GA20ox基因，明确通过在木材中特异调控GA20ox特异性表达改造杨树木材纳米纤维素特性的可行性，为林木材性改良以及制浆造纸应用开拓新思路，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1a为杨树叶盘法遗传转化的共培养图；图1b为杨树叶盘法遗传转化的愈伤诱导图；图1c为杨树叶盘法遗传转化的抗性芽的筛选图(放大)；图1d为杨树叶盘法遗传转化的抗性芽的筛选图；图1e为杨树叶盘法遗传转化的抗性芽的生根培养图；图2为本专利技术实施例提供的qRT-PCR分析GA20ox在转基因杨树中的表达水平示意图；图3a为GA20ox过表达转基因84K与对照型的赤霉素GA3激素含量图；图3b为GA20ox过表达转基因84K与对照型的赤霉素GA9激素含量图；图3c为GA20ox过表达转基因84K与对照型的异戊烯腺嘌呤IP激素含量图；图4a为对照型植株的纳米纤维素AFM图；图4b为GA20ox过表达转基因84K杨树的纳米纤维素AFM图。具体实施方式下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。本专利技术提供了利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，利用木质部特异表达的糖基转移酶8D1启动子驱动赤霉素氧化酶GA20ox基因过量表达，改变杨树木材纳米纤维素特性。优选地，所述杨树为84K银腺杨(P.alba×P.glandulossa)。其中，通过获得在杨树茎秆木质部中特异表达的启动子8D1P驱动GA20ox基因过量表达的重组载体，并将所述重组载体用于农杆菌介导的84K杨树遗传转化，得到木材纳米纤维素特性改良的8D1P:GA20ox本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，包括利用木质部特异表达的糖基转移酶8D1启动子驱动赤霉素氧化酶GA20ox基因过量表达改变杨树木材纳米纤维素特性。

【技术特征摘要】
1.利用糖基转移酶8D1启动子驱动GA20ox改良纳米纤维素特性的方法，包括利用木质部特异表达的糖基转移酶8D1启动子驱动赤霉素氧化酶GA20ox基因过量表达改变杨树木材纳米纤维素特性。2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述杨树为84K银腺杨。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，包括通过获得在杨树茎秆木质部中特异表达的启动子8D1P驱动GA20ox基因过量表达的重组载体，并将重组载体用于杨树的遗传转化，得到纳米纤维素特性改良的8D1P:GA20ox转基因84K杨树；所述转基因杨树的木材纳米纤维素特性改良体现为纳米纤维素直径增大、纳米纤维素的长径比增大。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：过表达转基因植株相对于对照型植株的纳米纤维素直径增大1.5倍，纳米纤维素直径由对照组约40nm增加到约100nm。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述糖基转移酶8D1启动子通过在杨树木质部中特异性地过量表达GA20ox调节赤霉素(GA3，GA9)及异戊烯腺嘌呤(IP)的合成促进杨树生长，并改变杨树木材纳米纤维素特性。6.一种培育木材纳米纤维素特性改良的转基因杨树的方法，其包括：A、获得包括糖基转移酶8D1启动子和赤霉素氧化酶GA20ox基因的表达盒，并构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭霄鹏，李全梓，文甲龙，王晨璨，许辰，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11