一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物及其检测方法技术

技术编号:19448230 阅读:64 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术公开了一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物及其可视化检测方法,专用于马铃薯早疫病菌特异检测。主要采用一种马铃薯早疫病菌的环介导扩增引物F3、B3、FIP、BIP,经过环介导恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测,可观察到绿色荧光或出现环介导扩增特征性的梯形带。所发明专利技术的环介导扩增引物及其用法可被用于生产实践中马铃薯早疫病菌感染的植株的快速、灵敏、准确的检测,同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定,为马铃薯早疫病的防治提供可靠的技术和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物及其检测方法
本专利技术一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物及其检测用法,专用于马铃薯早疫病菌高特异性、灵敏度快速检测,同时可用于田间马铃薯早疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定,属于农作物病害检测、鉴定及防治

技术介绍
由茄链格孢菌(Alternariasolani)引起的早疫病是马铃薯生产上一种重要病害,在世界各马铃薯主产区均有发生和流行,严重威胁着马铃薯的生产,其造成的危害大,防治困难。早疫病在我国发生普遍而严重,已成为限制我国马铃薯生产和实现产业化的障碍。由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术,发病后盲目大量使用药剂防治引起农药残留,造成食品安全问题,而且防治效果不理想。因此,研发出马铃薯早疫病的早期快速诊断并进行及时监测,对保障马铃薯产业健康生产及食品安全至关重要。目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力,且检测结果可靠性低,免疫学检测技术的灵敏度较低,且抗体的制作过程耗时、复杂,检测成本高,PCR技术虽然快速、准确,但需昂贵的仪器设备,检测成本高,不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法,该方法短时间内实现产物的大量扩增,灵敏度比PCR高,且操作步骤简便,无需特殊设备,检测结果可由肉眼判断,极适合在基层生产部门推广应用。本专利技术基于环介导等温扩增(LAMP)技术,建立马铃薯早疫病菌的快速检测,根据环介导扩增技术原理,选取马铃薯早疫病菌的组氨酸激酶基因上的靶序列的6个区域,进而设计出4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,以钙黄绿素(Calcein)的荧光显色指示剂作用,建立可视化环介导扩增检测技术。该体系对马铃薯早疫病菌检测具有高的特异性与灵敏性,并在此基础上研发出可视化快速检测试剂盒。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段;无需特殊仪器设备,同时开发的快速检测试剂盒适合田间马铃薯生产中开展实地检测与监测,从而保障马铃薯健康生产及食品安全。目前,对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离,通过对已经分离并纯化的病菌进行培养,观察,完成形态上的鉴定工作。同时,将病原菌回接到植株中,进行致病性的验证。最后,对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用,有着很强实用性,是病原菌的鉴定及病害检测的方法之一,但是该方法受人为因素和环境的影响,对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求,十分耗时,无法达到快速检验的要求。免疫学检测技术(Immunologicaltechnology)具有操作简单、特异性强,以及检测时间短的优点,适合开发检测试剂盒。但其不能对检测对象进行扩增,所以灵敏度不及核酸检测技术高。另外,抗体的制作过程耗时、复杂,提高了检测的成本。这两点缺点限制了免疫学检测技术的推广使用。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术,该技术是病原检测最常规的方法之一,广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强,已成为病原菌检测重要的技术之一,主要包括常规PCR、巢式PCR(Nest-PCR)和实时荧光定量PCR等,主要的缺点是需要依靠PCR等仪器设备,不利于基层生产上推广应用。环介导等温扩增(Loop-mediatedIsthermalAmplification,LAMP)技术是由日本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法(Notomietal.,2000)。环介导扩增技术是一种新型的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下,可在短时间内使产物得到大量扩增,在短短的30-60min内就能实现109-1010倍的扩增。同时具有很高的灵敏度和特异性,且操作简便,检测结果可肉眼判断,反应结束后用肉眼观察是否产生焦磷酸镁沉淀,即可判断靶序列是否存在。亦可在反应液中加入荧光指示剂,使反应结果的肉眼观察更加的方便、直观和可靠。环介导扩增技术操作简单、快速高效,而且检测特异性非常强,其最大的优势就是在恒温条件即可进行扩增反应,无需特殊实验设备,相较于普通PCR技术,其有很多优点(表1)。表1.环介导扩增技术与常规PCR技术比较综上,目前植物病害的检测主要有传统检测和分子生物学检测。其中,传统检测法耗时、耗力,检测结果可靠性往往比较低;分子生物学检测法主要有常规PCR、Nest-PCR和qPCR等,PCR方法能快速、准确地检测病原,但需特定仪器设备,且检测成本比较高,不适合基层检验检疫部门的推广应用,使田间病情难以得到及时、准确的检测,严重阻碍了马铃薯产业发展。基于目前马铃薯早疫病在我国严重发生,因此,建立一套简便、快速、准确、有效、经济的马铃薯早疫病菌的检测技术非常重要。此技术可应用于马铃薯早疫病菌引起病害显症之前的早期监测,对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用,为防治策略的制定提供技术支持。由于环介导扩增反应具有简单、快速、高效、经济等特征,因而具有极为广泛的应用前景。目前环介导扩增检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测,在植物病原菌检测中报道极少,马铃薯早疫病菌的检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中马铃薯早疫病菌的传统检测方法所需周期长、检测方法特异性差,PCR检测需要依靠扩增仪等设备,且灵敏度低的问题,提供一种马铃薯早疫病菌的环介导扩增检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的马铃薯早疫病菌的可视化检测方法。实现本专利技术的目的包括下列步骤:1.环介导扩增引物的设计根据马铃薯早疫病菌组氨酸激酶基因序列,采用PrimerExplorerV4软件设计了对马铃薯早疫病菌具有特异扩增作用的环介导扩增检测引物,包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP),引物序列分别为:F3:GCGCACGATCAACACCAT;B3:GCAGGACACGTTAGCATCG;FIP:ATCTGCCTTCGGTACCGACCTC-CAGCTCCAGGAGTTTGCC;BIP:AAGCCAACCTACCAGGAGTTGC-GCCCGATAGTGGAACCCTAA。2.马铃薯早疫病菌快速检测体系的建立环介导扩增检测:25μL反应体系中含20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mMKCl,8mMMgSO4,甜菜碱0.8mol/L,BstDNA聚合酶为8U,dNTPs1.0mmol/L,F3和B3为0.2mmol/L,FIP和BIP各1.6mmol/L,钙黄绿素50μmol/L,氯化锰500μmol/L,TWeen-200.1%,模板DNA50~100ng,不足部分用无菌双蒸水补足;环介导扩增反应条件为在63-65℃温育45-60min,85℃灭活5-10min。所述的检测方法为荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法:在环介导扩增反应后,显色结果观察到绿色荧光判断为阳性,橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物,其特征在于:所述环介导扩增引物如下:F3: GCGCACGATCAACACCAT;B3: GCAGGACACGTTAGCATCG;FIP: ATCTGCCTTCGGTACCGACCTC‑CAGCTCCAGGAGTTTGCC;BIP: AAGCCAACCTACCAGGAGTTGC‑GCCCGATAGTGGAACCCTAA。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物,其特征在于:所述环介导扩增引物如下:F3:GCGCACGATCAACACCAT;B3:GCAGGACACGTTAGCATCG;FIP:ATCTGCCTTCGGTACCGACCTC-CAGCTCCAGGAGTTTGCC;BIP:AAGCCAACCTACCAGGAGTTGC-GCCCGATAGTGGAACCCTAA。2.一种马铃薯早疫病菌的环介导扩增检测方法,其特征在于:利用权利要求1所述的引物进行环介导扩增反应,25μL反应体系中含20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mMKCl,8mMMgSO4,甜菜碱0.8mol/L,BstDNA聚合酶为8U,dNTPs1...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈庆河迈赫兰王荣波李本金刘裴清翁启勇
申请(专利权)人:福建省农业科学院植物保护研究所
类型:发明
国别省市:福建,35

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