一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法及其应用技术

技术编号:19448225 阅读:47 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术涉及基因编辑技术进行农作物育种技术领域,尤其是一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法及其应用。本方法通过对Ty‑5外显子区域进行基因编辑,利用植物自身对DBS的修复机制,引入DNA序列的缺失,使Ty‑5基因功能的丧失,从而获得雄性不育特性。本方法不局限于作物类别,当对各作物的Ty‑5基因进行基因编辑后,就可以快速获得与编辑前材料只在育性方面存在差异、其他农艺性状相同的新种质,有效解决了自然资源中雄性不育材料缺乏、育性不稳定的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法及其应用
本专利技术涉及基因编辑技术进行农作物育种
,尤其是一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法及其应用。
技术介绍
作物雄性不育是由于有性繁殖作物生理上或遗传上的原因造成雄性器官异常而导致的不能产生花粉或花粉败育,无法正常授粉的现象。因其在作物杂种优势育种中可以避免授粉过程中人工去雄的环节,节约了大量的劳动力投入,同时也可以显著的提高杂交种的纯度,创制具有杂种优势的品种。雄性不育技术对于杂种优势的利用发挥着重要的作用,获得稳定的雄性不育材料具有重要的应用价值。雄性不育根据其遗传方式和在细胞中的定位可将其分为细胞核雄性不育和核质互作雄性不育。目前在水稻、玉米、小麦、甘蓝、辣椒等作物中都已开展了对雄性不育的应用。但在很多作物中,雄性不育并未用于生产,缺乏雄性不育资源、雄性不育材料的不育性状不稳定是其面临的主要问题。通过发现自然突变的雄性不育系材料是雄性不育材料的主要来源,此外还可以通过远缘杂交、人工诱变、细胞工程等手段获得雄性不育材料。随着生物技术的发展,通过基因工程创制雄性不育材料已经成为可能。基因Ty-5是番茄中的抗番茄黄化曲叶病基因,该基因也是监控肽链合成过程中的监控因子,该基因在所有作物中都存在。本案通过对该基因进行基因编辑,可以快速创制出雄性不育的新种质。基因编辑技术的发展,为Ty-5基因在杂种优势育种中的利用提供了有力的武器。目前的基因编辑技术主要有锌指核酸酶技术、类转录激活因子效应物核酸酶技术,以及最新的CRISPR/CAS9基因编辑技术。基因编辑实现了对特定DNA序列的识别、剪切,并在DNA双链断裂位点(double-strandbreaks,DSBs)处引入碱基的缺失、替换、插入等不同突变类型,实现对DNA的定点编辑。
技术实现思路
本专利技术针对作物中现有雄性不育材料不足,杂交种纯度不高的问题,以及常规育种时间长,成本高的现状,通过基因编辑的手段对Ty-5基因进行基因编辑,快速创制雄性不育作物新种质,同时保留原雄性可育材料的农艺性状不变。为解决上述技术问题,本专利技术通过以下技术方案得以解决:(1)已有基因编辑手段均可以用于本研究对Ty-5的编辑,本专利技术仅列出利用CRISPR/Cas9技术对Ty-5的基因编辑,利用植物自身对DBS的修复机制,引入DNA序列的缺失,使Ty-5基因功能的丧失,从而获得雄性不育特性;(2)gRNA靶位点选择在Ty-5基因的外显子区域,根据CRISPR/Cas9靶位点锚定原理,选取原型间隔序列毗邻基序(protospacer-associatedmotif,PAM)上游18-20bp碱基作为靶位点,即(5'-N18-20NGG-3',NGG为PAM序列,N18-20代表18-20bp碱基的识别序列);(3)根据识别序列设计oligo序列引物:Target-Sense:5’-TTG-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N表示gRNAsense序列)Target-Anti:5’-AAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N表示gRNAsense的反向互补序列)将引物浓度稀释为10μm,取上述引物各5μl,加水15μl,混匀。95℃放置3分钟,之后慢慢冷却至25℃,之后16℃5分钟,完成oligo二聚体的合成;(4)选用北京唯尚立德生物科技有限公司的CRISPR/Cas9试剂盒VK005-14,利用已合成的oligo二聚体1μl,Cas9/gRNA载体1μl,Solution和Solution2各1μl,H2O加入6μl混合均匀,16℃反应2h;(5)将连接后的载体转入大肠杆菌感受态,挑取单克隆进行质粒测序分析,测序引物为sqprimer:5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’,将测序结果阳性的质粒,转入农杆菌GV3101;(6)以作物子叶为外植体,通过叶盘法进行植株再生,用阳性农杆菌GV3101介导转化,经过潮霉素抗性筛选,获得再生植株;(7)根据靶位点上下游序列,设计可以扩增靶位点的引物,提取再生植株DNA,以其为模板进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,对再生植株的是否发生基因编辑,以及编辑类型是否为纯合突变进行测序分析;(8)测序分析后,纯合基因编辑类型的株系进行花粉含量和萌发的鉴定,鉴定结果显示基因编辑创制的纯合编辑Ty-5的植株即为雄性不育新种质。与现有技术相比,本专利技术的有益效果是:(1)本专利技术所提供的创制雄性不育作物新种质的方法,不局限于作物类别,当对各作物的Ty-5基因进行基因编辑后,就可以快速获得与编辑前材料只在育性方面存在差异、其他农艺性状相同的新种质,有效解决了自然资源中雄性不育材料缺乏、育性不稳定的问题。(2)本专利技术的方法较常规育种可以更快的赋予材料雄性不育的特性;(3)本专利技术的方法较常规育种可以更好的保留受体材料的农艺性状;(4)通过本专利技术创制的雄性不育新种质是对现有材料的有力补充;(5)利用本专利技术创制雄性不育方法所创制的材料进行杂交制种,可以极大的减少用工,提高杂交种纯度。附图说明图1为基因编辑引物对编辑后再生植株扩增图谱;(M:100bpMarker;1:基因编辑后1号再生植株;2:基因编辑后2号再生植株;3:野生型Moneymaker材料);图2为CRISPR5-F引物对各材料扩增条带测序结果(a:1号再生植株;b:野生型moneymaker测序结果;c:2号再生植株;三角框分别表示1号和2号再生植株缺失的序列);图3为花粉萌发比较;(a:1号再生植株;b:野生型moneymaker;c:2号再生植株)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图,对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法,包括以下步骤:(1)材料番茄材料:感番茄黄化曲叶病材料moneymaker;CRISPR/Cas9试剂盒:北京唯尚立德生物科技有限公司的CRISPR/Cas9试剂盒VK005-14;T载体:北京全式金生物技术有限公司(CT301-01);DNA提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司(DP305);农杆菌感受态:GV3101;引物合成及测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。(2)gRNA靶位点的选择Ty-5基因全长序列(如SEQIDNO.1所示)共包含16个外显子,本实施例选择第二个外显子序列进行gRNA靶位点的设计。靶序列长19bp(如SEQINNO.2所示)。根据靶序列,设计引物:Target-F:5’-TTG-AGAAGAAGCTGATGATCTA-3’,如SEQINNO.3所示,Target-R:5’-AAC-TAGATCATCAGCTTCTTCT-3’,如SEQINNO.4所示;(3)oligo二聚体合成:将Target引物稀释为10μm,取上述引物各5μL,加水15μL,混匀。95℃放置3分钟,之后慢慢冷却至25℃,之后16℃5分钟,完成oligo二聚体的合成;(4)CRISPR/Cas9重组载体的构建及农杆菌转化反应体系为:本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法,其特征在于:通过对Ty‑5外显子区域进行基因编辑,利用植物自身对DBS的修复机制,引入DNA序列的缺失,使Ty‑5基因功能的丧失,从而获得雄性不育特性。

【技术特征摘要】
1.一种通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法,其特征在于:通过对Ty-5外显子区域进行基因编辑,利用植物自身对DBS的修复机制,引入DNA序列的缺失,使Ty-5基因功能的丧失,从而获得雄性不育特性。2.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法,其特征在于:利用CRISPR/Cas9技术对Ty-5的基因编辑。3.根据权利要求2所述的通过基因编辑创制雄性不育作物新种质的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)gRNA靶位点的选择gRNA靶位点选择在Ty-5基因的外显子区域,根据CRISPR/Cas9靶位点锚定原理,选取原型间隔序列毗邻基序上游18-20bp碱基作为靶位点,即5'-N18-20NGG-3',NGG为PAM序列,N18-20代表18-20bp碱基的识别序列;(2)根据识别序列设计oligo序列引物:Target-Sense:5’-TTG-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN,其中,N表示gRNAsense序列;Target-Anti:5’-AAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN,其中,N表示gRNAsense的反向互补序列;将引物浓度稀释为10μm,取上述引物各5μL,加水15μL,混匀;95℃放置3分钟,之后慢慢冷却至25℃,之后16℃5分钟,完成oligo二聚体的合成;(3)CRISPR/Ca...

【专利技术属性】
技术研发人员:王银磊赵统敏余文贵赵丽萍周蓉宋刘霞
申请(专利权)人:江苏省农业科学院
类型:发明
国别省市:江苏,32

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